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PI3K催化亚基p110α和S6K1在小鼠受精卵早期发育中作用的研究

作　者: 徐小燕
导　师: 于秉治
学　校: 中国医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 小鼠1-细胞期受精卵 p110α Akt Cdc2 mTOR raptor rictor S6K1
分类号: Q55
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

前言磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3Ks）是参与酪氨酸激酶受体介导的信号传导酯激酶,由三类复杂的家族成员组成,每一类有多个亚单位和亚型。PI3Kα是这个家族中研究最多的一种酶,它是具有接头功能的异源二聚体蛋白,由一个催化亚基（p110αc）和一个85kDa的调节亚基（p85α）组成。PI3K信号传导通路是细胞生长、增殖、存活、肿瘤发生的调节因子。许多文献已提示PI3K在许多类型细胞周期进程中起中枢调控作用,PI3K不仅在G1/S期转换时起作用,还可能调节G2/M期转换效率,但是在此进程中PI3K亚型的特异作用尚未详尽阐释。目前有关PI3K在哺乳动物受精卵早期发育过程中作用报道仍然很少。尽管已有文献报道PI3K可能在前植入胚泡中调控细胞的葡萄糖代谢,但是PI3K各亚型在胚胎发育中的生理作用尚未进行深入探讨。ⅠA型PI3K的催化亚基p110α不仅在果蝇的细胞生长中起作用,而且在小鼠的早期胚胎发育中也起重要作用。但该作用的机制是什么,从何时开始发挥尚不清楚。在过去的十几年中,很多学者进行了PI3K/Akt（蛋白激酶B/PKB）通路广泛的研究,研究提示该通路在细胞的迁移、有丝分裂发生、分化、细胞存活中起到关键调节子的作用。一些结果显示Akt在哺乳动物细胞的周期进展中促进G2/M期转换,然而尚未完全了解PI3K/Akt信号通路的直接联系以及它们在G2/M转换中的调控作用。在分裂的真核细胞中,M期促进因子（MPF）掌控有丝分裂的入口。MPF可能通过磷酸化与去磷酸化cdc2对G2/M转换进行紧密调节。对受精卵这一天然的细胞周期模型进行深入研究,有利于揭示细胞周期调控机制,对生长、发育、癌变、死亡有进一步认识。小鼠受精卵是脊椎动物中与人类种属较为接近的细胞周期模型,但由于取材有限,关于小鼠受精卵早期发育机制的研究,尤其是1-细胞期向2-细胞期转换,即G2/M期转换机制的研究进展缓慢,因此也成为国际上研究的热点之一。鉴于PI3K在体细胞信号传导,有丝分裂发生,卵母细胞减数分裂成熟中的重要性,以及p110α等位基因纯合状态的缺失导致小鼠胚胎致死,因此我们首先选定p110α在小鼠早期胚胎发育中的作用进行研究。我们前一部分工作对小鼠1-细胞期受精卵中PI3KⅠA型催化亚基p110α的表达及其细胞定位进行了初步检测,为了作进一步的研究,通过使用p110αshRNA和p110α的三种mRNA构建体来研究p110α的生物学功能,检测p110α对小鼠受精卵早期发育的作用及其作用途径。本实验室的前期实验已经证实PI3K的下游mTOR可能参与小鼠1-细胞期受精卵中G2/M期的转换过程,mTORC2可能通过作用Akt Ser473位点调节受精卵的发育,但是在受精卵的发育过程中,mTORC1作用底物和调节机制以及除Akt外mTORC2的其他作用底物还未明确。文献报道在体细胞中S6K1是mTOR的下游靶蛋白之一,作用机制比较明确,然而S6K1在早期小鼠胚胎发育中的细胞周期效果以及与mTORC1/mTORC2之间的作用机制未被完全阐述清楚。在小鼠胚胎细胞周期进展中,为了更好的较全面了解S6K1的功能,我们针对S6K1和Thr389位磷酸化S6K1的表达,亚细胞定位进行了详细的研究。本实验在前期工作的基础上,针对PI3K的下游mTOR的两个亚型在小鼠受精卵早期发育过程中的影响作进一步的研究,通过使用mTOR shRNA、rictor shRNA和raptor shRNA干扰对应蛋白的表达,来研究mTOR信号网络各分支在小鼠胚胎发育中对S6K1磷酸化的调控作用。材料与方法一、材料与试剂中国医科大学实验动物部提供昆明系雌性小白鼠;一抗（Santa Cruz）,碱性磷酸酶连接的二抗（Sigma）,ECL发光试剂盒（Pierce公司）,快速微量mRNA提取纯化试剂盒（GE Healthcare UK公司）,RNAPCR Kit（AMV）Ver 2.1（Takara公司）。pBJ-p110α-WT,pBJ-p110α-AC,pBJ-p110α-KD由Anke Klippel教授惠赠。PH1-p110αshRNA/control shRNA由Osamu Hazeki教授（Hiroshima University）惠赠。pSUPER-mTOR shRNA,pSUPER-raptor shRNA和pSUPER-rictor shRNA由Estella Jacinto教授惠赠。E.coli DH5α感受态细菌、氨卞青霉素（Takara公司）,LB培养基（Invitrogen）,UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒以及质粒小量提取试剂盒（上海生工）,去内毒素质粒中量提取试剂盒（OMEGA公司）,O-dianidine、β-naphthyl acid phosphate、PKB及MPF活性测定试剂均为Sigma公司产品。二、小鼠超排卵及受精卵的采集和培养昆明系小白鼠,4～5周龄成熟雌鼠,腹腔注射PMSG 10IU/只,48小时后腹腔注射hCG 10IU/只,当晚与8周龄以上性成熟雄性昆明系小鼠合笼过夜,次日晨检查雌鼠阴栓,有阴栓者视为交配成功,脱颈法处死雌鼠,取双侧输卵管,剪下末端膨大置于M2培养液中,在实体显微镜下撕开壶腹部,让卵细胞团自然流出,透明质酸酶除颗粒细胞,在M2培养液中洗三次,接受不同形式mRNA或shRNA注射,注射后在M16培养液中洗两次后转入12孔板,每孔加入200μl预先在培养箱中平衡的M16培养液,上覆矿物油,在37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱内培养。三、重组载体的构建设计基因特异性引物a、b,以克隆在质粒野生型（WT）/失活型（KD）/激活型（AC）pBJ-p110α上的p110α-WT/AC/KD cDNA为模板,5′端引入BamHI酶切位点,3吲入XbaI酶切位点,以a、b为引物,扩增各型p110α。用限制性内切酶BamHI和XbaI将p110α-WT/AC/KD cDNA亚克隆到表达载体pcDNA3.1（+）上,简称为pCDNA3.1-p110αWT/AC/KD。所有重组载体均经测序鉴定基因插入正确。四、体外转录各种重组体分别取1μg,经AgeI酶切线性化,应用体外转录试剂盒将线性模板体外转录成带帽mRNA,然后用2U TURBO DNase于37℃反应15 min消化DNA模板,用酚、氯仿抽提纯化mRNA,最后应用氯化锂沉淀mRNA。五、mRNA显微注射显微注射应用倒置显微镜显微操作系统:OLYMPUS IX70研究级倒置显微镜、NARISHIHGE ON2显微操作系统、注射针制作装置、JVC/SONSY视频记录仪器等,HOFFMAN调制相差观察。将G1期受精卵移入到M2液滴中,用持卵针将受精卵固定,将注射针吸好一定量的p110αWT/AC/KD mRNA刺入细胞将样品注入胞浆。为尽量减少显微注射对受精卵的影响,一般注入到受精卵内的样品体积为10 pl（相当于其总体积的5%）。对照组注射TE缓冲液。六、shRNA胞核显微注射将G1期受精卵移入到M2液滴中,用持卵针将受精卵固定,将吸好一定量无内毒素质粒PH1-p110αshRNA或者pSUPER-mTOR shRNA/raptor shRNA/rictorshRNA的注射针刺入细胞将样品注入胞核。为尽量减少显微注射对受精卵的影响,一般注入到受精卵内的样品体积为10 pl（相当于其总体积的5%）。对照组为TE缓冲液注射组及control shRNA注射组。七、RT-PCR检测1-细胞期受精卵中p110α、mToR、raptor、rictor和S6K1的mRNA水平100个各期受精卵收集到2ml微量离心管中,按Ellustra^TM QuickPrep MicromRNA Purification试剂盒说明书进行:主要包括:样品的提取,mRNA的分离,分别用高盐缓冲液和低盐缓冲液对已结合mRNA的oligo（dT）纤维颗粒的洗涤,mRNA的洗脱。用TaKaRa RNA PCR（AMV）Ver3.0试剂盒,按操作步骤进行反转录和PCR:p110α（NM₀08839）的引物:5’-GAACCAGTAGGCAACCGTGAA-3’和5’-GCATCCTCCCCAGCATTAT-3’,预计产物长度541bp;S6K1（NM₀28259.4）的引物:5’-AGGGACTGGAGAGATGGGTC-3’和5’-GATCTGGGCAGGAGACAGAA-3’,预计产物长度644 bp;mTOR（NM₀20009.1）的引物:5’-GCACATTGACTTTGGGGACT-3’和5’-TCATGAGAGAAATCCCGACC-3’,预计产物长度486 bp。raptor（NM₀28898.2）的引物:5’-GGCGGACCTTACAGATTGG-3’和5’-TTGGCTGCCAGTTCTCATAC-3’,预计产物长度293 bp,rictor（NM₀30168.3）的引物:5’-CGAAGC ATTTCCTGTCCC-3’和5’-ACGGCTCCTGGTG ACTTG-3’,预计产物长度1348 bp。β-actin（NM₀07393.3）作为内对照,引物:5’-ACACT GTGCCCATCTACG-3’和5’-CAGGATTCCATACCCAAG-3’,预计产物长度334 bp。PCR反应体系为25μl,反应条件是①94℃,3min;②94℃,30sec;③p110α55℃,S6K1 58℃,mTOR 57℃,raptor 54℃,rictor 50℃,β-actin 54℃,30sec;④72℃,1 min;⑤72℃,10min;②-④循环30-31周。反应产物经琼脂糖凝胶电泳后成像。八、Western印迹收集小鼠1-细胞分裂各期的受精卵各150枚,转移到1.5ml Eppendof管中,4℃3000rpm离心10min,尽量去除培养液,加入适量粉碎缓冲液（20mmol/LTris-HCl,pH7.5,2mmol/L EDTA,10mmol/L EGTA,0.25mmol/L Glucose）,充分振荡混匀,然后经3～4次冻融循环,迫使卵细胞裂解,置于-20℃备用。电泳前,加入SDS样品缓冲液,100℃煮沸5 min,离心后上样,SDS-PAGE电泳分离,然后将蛋白转至硝酸纤维素膜上,之后用含5%BSA的TBS（pH7.4）将硝酸纤维素膜于室温摇动温育1h进行封闭,封闭后的硝酸纤维素膜再与特异性的抗体4℃孵育过夜。经TBST洗涤后,碱性磷酸酶偶联的IgG作为二抗（稀释比为1:10000）室温温育2 h,洗膜后,O-dianidine及β-naphthyl acid phosphme作为碱性磷酸酶底物显色。九、细胞免疫荧光定位将培养到指定时间点的卵细胞,用酸性台氏液处理1—2分钟去除透明带,用含0.1%BSA的PBS作为洗液,洗涤3遍,4%多聚甲醛（融解于PBS中）室温固定1小时,或4℃固定过夜,PBST（PBS加0.01%Tween20）洗涤3遍,0.1%Triton X-100（融解于PBS）打孔30分钟。用封闭液（含5%BSA的PBS）封闭1小时,将卵细胞转入一抗（抗体用封闭液按1:100稀释）中4℃过夜,或室温2小时,洗液洗涤3次,每次5分钟,将卵细胞转入二抗（FITC标记IgG用封闭液按1:100稀释）中,室温下孵育1小时,洗液洗涤3次,每次5分钟,再用碘化丙啶（propidium iodide,10μg/ml溶于PBS中）染色7分钟,使DNA染色。激光共聚焦扫描显微镜观察、照相。S6K1与raptor的双染:S6K1一抗孵育4℃过夜后,用FITC标记的驴抗羊二抗IgG孵育,胚胎洗液洗3次后,用raptor一抗孵育3小时,然后在TRITC连接的羊抗兔的二抗IgG（1:100）中孵育,洗液洗3次,用Hoechst33258（10μg/ml溶于PBS中）染色20分钟。最后用激光共聚焦扫描显微镜（400×放大率）照相。每组实验重复三次,每组中至少检测50个胚胎。每次实验仪器设置参数相同。十、放射自显影检测Akt活性和MPF活性将收集的鼠卵冻融3次,使细胞裂解,分别加XPKB反应液或MPF反应液45μl。30℃反应30分钟,后加入50μl 2XSDS上样缓冲液终止反应。取25μl反应后的样品进行SDS-PAGE电泳,电泳结束后把分离胶切下放在滤纸上,在分离胶的上面覆盖上保鲜膜,而后通过放射自显影的方法,通过底物蛋白H2B或底物组蛋白H1带有的³²P感光胶片,显影,漂洗,定影,冲洗,晾干。结果一、小鼠受精卵中p110α的表达水平为了进一步检测p110α在小鼠1-细胞期各个期中的蛋白表达水平,我们使用特异的p110α抗体。结果显示,无论在G1、S期,还是G2、M期,p110α的蛋白表达都保持恒定。我们还使用特异的引物对小鼠受精卵的cDNA进行PCR,结果显示,与蛋白表达水平一致,p110α在受精后四个期的mRNA水平无明显差异。二、p110α在1-细胞期或2-细胞期胚胎中的定位由于蛋白在细胞中的定位与功能相关,我们使用细胞免疫荧光的方法来检测p110α在1-细胞期或2-细胞期胚胎中的定位。结果显示,p110α定位在卵细胞的细胞膜上。这个结果说明了在小鼠受精卵的发育过程中p110α发挥作用可能与细胞膜上的蛋白密切相关。三、p110αshRNA抑制p110α的表达为了检测p110αshRNA是否可以削减内源性的p110α蛋白水平,在G1期显微注射TE、control shRNA或者p110αshRNA的受精卵于M16培养液中进行培养。在20小时的培养后,收集卵细胞进行RT-PCR和Western Blot实验。结果显示1mg/ml的p110αshRNA可以较彻底的抑制内源性p110α的表达,而对照组TE与control shRNA注射组则相反。四、p110αshRNA和p110αmRNA调控1-细胞期受精卵的分裂分别在hCG注射27h和32h后计算每组细胞的分裂率。在对照组,hCG注射后27小时,胚胎未分裂,在hCG后32h,68%的1-细胞胚胎分裂成2-细胞胚胎。三个对照组组间没有明显的区别。与control shRNA处理组的胚胎相比,p110α的沉默明显抑制1-细胞胚胎的分裂,说明p110αshRNA干扰小鼠1-细胞胚胎的G2/M期转换。显微注射p110α-WT mRNA的1-细胞期胚胎在hCG注射27h后处于1-细胞阶段,在32h后79%的胚胎达到2-细胞阶段。显微注射p110α-AC mRNA的1-细胞期胚胎在32h的分裂率达到90%,并且分裂加速,在27h已有24%的胚胎分裂。在32h可见不规则分裂。相比,注射hCG32h后,约38%显微注射p110α-KD mRNA的胚胎进行分裂。显微注射不同的p110αmRNA,不仅可以调节1-细胞胚胎的分裂时程,而且可以调节胚胎的分裂率。五、p110αshRNA和p110αmRNA的显微注射调节Akt和MPF的活性通过p110αshRNA和各组p110αmRNA显微注射到胚胎,调控1-细胞阶段的胚胎发育,提示p110α在调控小鼠胚胎分裂方面的作用。为进一步研究p110α调控1-细胞胚胎发育潜在机制,通过内源性p110α的缺失以及p110α三种mRNA的过表达,检测p110α在Akt和MPF信号通路上的效应。首先,确定1-细胞期胚胎中的内源性Akt的激活时程。Akt的活性在hCG注射后27h达到峰值,在28-30hAkt的活性明显降低。因此我们选择在hCG注射后26-27h检测Akt的活性变化。在p110αshRNA显微注射组与control shRNA对照组相比,Akt的活性明显降低。在p110α-WT mRNAmRNA显微注射组,Akt的活性几乎是对照组活性的2倍;在p110α-AC mRNA显微注射组,Akt的活性几乎是对照组活性的3倍。然而,在p110α-KD mRNA显微注射组,Akt的活性却低于对照组的活性。然后我们检测在各实验组与对照组中MPF在不同时间点的活性。结果显示在对照组,MPF的峰值在hCG注射后28-29h出现,比Akt的活性延迟约1 h出现。相比,p110αshRNA实验组,MPF的活性远远低于对照组。在p110α-WT实验组,MPF活性在hCG注射后27.5h左右达到峰值,早于对照组30min出现峰值。在p110α-AC实验组,MPF的活性峰值在hCG后27h出现,比对照组早出现1h左右。在p110α-KD实验组,MPF活性在hCG后29h出现,而且活性比对照组低得多。我们的实验结果证明在小鼠受精卵中p110α的沉默以及p110α的各种构建体的表达调控Akt和MPF的活性值和活性时程的变化。六、小鼠受精卵各期中S6K1的表达和定位S6K1的mRNA水平在G1、S、G2、M期似乎没有什么变化。通过蛋白免疫印迹分析显示S6K1在小鼠受精卵的各期中70KD的条带在强度或者移动率方面也没有什么变化。通过免疫荧光染色分析S6K1的亚细胞定位,显示代表S6K1的绿色荧光信号主要分布在1-细胞的胞浆中。七、小鼠受精卵中Thr389位磷酸化的S6K1的表达和定位Thr389位磷酸化的S6k1可以反映S6K1的活性,通过蛋白印迹实验检测Thr389位磷酸化的S6k1表达情况。Thr389磷酸化的S6k1在小鼠受精卵中从G1期到M期一直出现,在G2期和M期的表达明显增高,灰度值统计分析表明,差异具有显著性,说明S6K1在整个1-细胞期中是有活性的。既然蛋白的细胞定位在某种程度上反映蛋白的功能,通过免疫荧光染色的方法检测Thr389磷酸化的S6k1的定位,实验结果显示Thr389位磷酸化的S6k1主要定位在1-细胞胚胎的细胞膜,但是在胞浆仍旧有微弱的染色。八、raptor和S6K1的共定位通过用S6K1与raptor抗体的双染检测S6K1与raptor的定位是否相关。S6K1的分布与raptor的分布是一致的,二者同时定位在胚胎的胞浆中。九、mTORC1对S6K1的Thr389磷酸化起作用为了检测哪一型mTOR的复合物对于S6K1的磷酸化是主要的,使用小发夹RNA干扰的方法抑制mTOR以及它的相关蛋白的表达。结果显示mTOR shRNA的显微注射可以抑制mTOR的转录,raptor shRNA可以降低raptor的mRNA水平,同理rictor shRNA。在注射pSUPER-mTOR shRNA/raptor shRNA/rictor shRNA的受精卵中β-actin的mRNA水平一致。削减的mTOR或者raptor的表达,可以强烈的抑制S6K1Thr389的磷酸化,而rictor不能。结论1、小鼠受精卵第一次有丝分裂过程中p110α分布在1-细胞期和2-细胞期胚胎的细胞膜上,含量却不变。2、p110α表达沉默可降低Akt和MPF活性,进而干扰受精卵G2/M期转换,使卵裂率明显降低。编码结构活性p110αmRNA比野生型p110αmRNA更有效的促进受精卵的分裂率;激酶失活型p110αmRNA延迟首次有丝分裂。进一步研究显示p110α可能通过PI3K/Akt的信号传导通路影响MPF的活性,进而促进小鼠胚胎的早期发育。3、小鼠1-细胞期受精卵的四个期（G1/S/G2/M）中S6K1表达水平一致,T389位磷酸化的S6K1在G2期和M期高表达。raptor亚基与mTOR结合可诱导S6K1的T389位磷酸化,并向细胞膜移动。

全文目录

中文论著摘要  6-15
英文论著摘要  15-25
英文缩略语  25-27
论文一  27-35
  前言  27-28
  实验材料  28-29
  实验方法  29-31
  实验结果  31-33
  讨论  33-34
  结论  34-35
论文二  35-59
  前言  35-36
  实验材料  36-37
  实验方法  37-45
  实验结果  45-55
  讨论  55-58
  结论  58-59
论文三  59-74
  前言  59-61
  实验材料  61-62
  实验方法  62-65
  实验结果  65-70
  讨论  70-73
  结论  73-74
本研究创新性的自我评价  74-75
参考文献  75-82
综述  82-93
  参考文献  89-93
在学期间科研成绩  93-94
致谢  94-95
个人简介  95

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