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1α，25-二羟维生素D_3对人输卵管上皮细胞calbindin-D28k表达调控的研究

作　者: 张纯
导　师: 朱伟杰
学　校: 暨南大学
专　业: 妇产科学
关键词: 人输卵管 黏膜上皮 维生素D受体 免疫组织化学 逆转录聚合酶链反应 输卵管妊娠 人输卵管上皮细胞 体外培养 1α,25-二羟维生素D3 细胞增殖 钙结合蛋白calbindin-D28k 免疫印迹
分类号: R714.22
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的:1.研究月经周期不同时期人输卵管黏膜上皮维生素D受体（vitamin D receptor,VDR）蛋白及其mRNA的表达与变化,阐明人输卵管组织中是否存在VDR表达及其表达状况。2.检测输卵管妊娠病理状态下人输卵管黏膜上皮VDR蛋白的表达及其变化,分析人输卵管黏膜上皮VDR蛋白表达与输卵管妊娠发病的可能关系。3.体外培养人输卵管上皮细胞,观察1α,25-二羟维生素D3（1α,25-dihydroxyvitamin D3,1α,25-（OH）2D3）对人输卵管上皮细胞增殖的影响。4.检测1α,25-（OH）2D3对体外培养人输卵管上皮细胞VDR、钙结合蛋白calbindin-D28k（CaBP-D28k）mRNA及其蛋白表达的影响,分析1α,25-（OH）2D3对人输卵管上皮细胞VDR、CaBP-D28k表达可能的调控作用,探讨1α,25-（OH）2D3调节人输卵管上皮细胞CaBP-D28k表达可能的作用机制。方法:1.应用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）法和逆转录聚合酶链反应（reversetranscription polymerase chain reaction,RT-PCR）法检测人输卵管黏膜上皮VDR蛋白及其mRNA的表达。2.应用IHC法检测输卵管妊娠病理状态下,种植部位和非种植部位人输卵管黏膜上皮VDR蛋白的表达。3.应用机械法结合差速贴壁原理获取并体外培养人输卵管上皮细胞,免疫细胞化学（immunocytochemistry,ICC）法鉴定上皮细胞纯度,建立人输卵管上皮细胞的体外培养体系。应用噻唑兰（3.（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT）比色法检测1α,25-（OH）2D3对体外培养人输卵管上皮细胞增殖的影响。4.应用RT-PCR法和免疫印迹（Western blot,WB）法检测1α,25-（OH）2D3对体外培养人输卵管上皮细胞VDR、CaBP-D28k mRNA及其蛋白表达的影响。结果:1.人输卵管黏膜上皮VDR蛋白及VDR mRNA的表达人输卵管黏膜上皮可检测到VDR蛋白及其mRNA表达。VDR蛋白主要表达于人输卵管上皮细胞的细胞核内,部分间质平滑肌细胞核内亦可见阳性染色。相同时期各不同部位人输卵管上皮细胞VDR蛋白表达无明显差别（P＞0.05）,随月经周期变化,各不同部位输卵管上皮细胞VDR蛋白表达发生改变,在增生早期和分泌中晚期较低,与之比较,在增生中晚期和分泌早期其表达明显增高（P＜0.01）,至分泌早期达最高值。壶腹部人输卵管黏膜上皮组织VDR mRNA表达在增生早期和分泌中晚期较低,在增生中晚期和分泌早期明显增高（P＜0.01）。2.输卵管妊娠病理状态下人输卵管黏膜上皮VDR蛋白的表达输卵管妊娠病理状态下,种植部位和非种植部位人输卵管黏膜上皮均可检测到VDR蛋白阳性表达。VDR蛋白阳性表达于输卵管上皮细胞的细胞核内,部分间质平滑肌细胞核内亦可见阳性染色。种植部位人输卵管上皮细胞VDR蛋白表达较低,与之比较,非种植部位输卵管上皮细胞VDR蛋白表达明显增高（P=0.017,P＜0.05）。3.人输卵管上皮细胞培养、鉴定及1α,25-（OH）2D3对其细胞增殖的影响应用机械法结合差速贴壁原理获取并体外培养的人输卵管上皮细胞均可生长并传代,处于卵泡期或黄体期的人输卵管上皮细胞体外生长状况无显著差异。细胞角蛋白ICC染色结果显示,原代培养及传代第1-3次的细胞,其染色阳性细胞占培养细胞总数的90%以上,可用于后面的实验。以不同浓度1α,25-（OH）2D3处理体外培养人输卵管上皮细胞不同时间,人输卵管上皮细胞吸光度值(A490)无明显变化（P＞0.05）。4.1α,25-（OH）2D3对人输卵管上皮细胞VDR、CaBP-D28k mRNA及其蛋白表达的影响以不同浓度1α,25-（OH）2D3处理体外培养人输卵管上皮细胞12 h,与空白对照、酒精对照组比较,10-7mol/L 1α,25-（OH）2D3组细胞VDR、CaBP-D28k mRNA表达均明显升高（P＜0.05或0.01）,且10-8mol/L 1α,25-（OH）2D3组细胞VDR、CaBP-D28k mRNA表达量之间呈正相关（r=0.968,P=0.032,P＜0.05）。以10-7mol/L 1α,25-（OH）2D3处理体外培养人输卵管上皮细胞不同时间,与对照组（0 h）比较,干预6 h、12 h组细胞VDR、CaBP-D28k mRNA表达均显著升高（P＜0.05或0.01）,且处理0 h、3 h、6 h、24 h、48 h组细胞VDR、CaBP-D28k mRNA表达量之间呈正相关（r=0.968,0.977,0.973,0.976,0.993,P＜0.05或0.01）。WB检测结果显示,与对照组（0 h）比较,干预24 h、48 h组细胞VDR、CaBP-D28k蛋白表达均明显升高（P＜0.05或0.01）,且各组细胞VDR、CaBP-D28k蛋白表达量之间均呈正相关（r=0.981,0.982,0.962,0.984,0.985,0.977,P＜0.05）。结论:1.人输卵管黏膜上皮存在VDR蛋白及其mRNA表达,在增生中晚期和分泌早期其表达明显增高,且具有周期性变化。2.输卵管妊娠病理状态下,种植部位和非种植部位人输卵管黏膜上皮VDR蛋白表达不同。与种植部位比较,非种植部位人输卵管黏膜上皮VDR蛋白表达显著增高。3.机械法结合差速贴壁原理可获取纯度较高的人输卵管上皮细胞,1α,25-（OH）2D3不影响体外培养人输卵管上皮细胞的增殖。4.在体外培养条件下,1α,25-（OH）2D3可能通过VDR上调人输卵管上皮细胞CaBP-D28kmRNA及其蛋白的表达。

全文目录


中文摘要  4-7
Abstract  7-14
前言  14-29
  1 引言  14-15
  2 1α,25-(OH)_2D_3的体内合成及代谢  15-16
  3 1α,25-(OH)_2D_3的作用机制  16-17
    3.1 1α,25-(OH)_2D_3的基因组机制  16
    3.2 1α,25-(OH)_2D_3的非基因组机制  16-17
  4 1α,25-(OH)_2D_3对VDR表达的调控  17-18
  5 雌(女)性生殖系统中1α,25-(OH)_2D_3及其受体的国内外研究现状  18-21
    5.1 1α,25-(OH)_2D_3及其受体在卵巢中的表达与作用  18
    5.2 1α,25-(OH)_2D_3及其受体在输卵管中的表达与作用  18-19
    5.3 1α,25-(OH)_2D_3及其受体在子宫中的表达与作用  19-20
    5.4 1α,25-(OH)_2D_3及其受体在宫颈中的表达与作用  20-21
  6 CaBP-D28k在雌(女)性输卵管的表达与作用  21
  7 1α,25-(OH)_2D_3-VDR对CaBP-D28k表达的调控  21-22
  8 本研究的目的与意义  22-23
  参考文献  23-29
第一部分 VDR蛋白及其mRNA在人输卵管黏膜上皮的表达  29-50
  1 材料与方法  29-36
    1.1 研究对象及标本采集  29
    1.2 主要实验仪器与设备  29-30
    1.3 主要实验试剂  30-31
    1.4 主要溶液的配制  31-32
    1.5 实验方法  32-36
    1.6 统计学分析  36
  2 结果  36-39
    2.1 VDR蛋白在人输卵管黏膜上皮的表达  36-38
    2.2 VDR mRNA在人输卵管壶腹部黏膜上皮的表达  38-39
  3 讨论  39-42
  本部分小结  42-43
  图版  43-48
  参考文献  48-50
第二部分 输卵管妊娠病理状态下人输卵管黏膜上皮VDR的表达  50-64
  1 材料与方法  50-53
    1.1 研究对象及标本采集  50
    1.2 主要实验仪器与设备  50-51
    1.3 主要实验试剂  51
    1.4 主要溶液的配制  51
    1.5 实验方法  51-52
    1.6 统计学分析  52-53
  2 结果  53-54
    2.1 妊娠囊种植部位组织学判定  53
    2.2 输卵管妊娠病理状态下人输卵管黏膜上皮VDR蛋白的表达  53-54
  3 讨论  54-56
  本部分小结  56-57
  图版  57-61
  参考文献  61-64
第三部分 人输卵管上皮细胞体外培养及1α,25-(OH)_2D_3对其细胞增殖的影响  64-83
  1 材料与方法  64-73
    1.1 人输卵管组织来源  64
    1.2 主要实验仪器与设备  64-65
    1.3 主要实验试剂  65-66
    1.4 主要溶液的配制  66-69
    1.5 实验方法  69-73
    1.6 统计学分析  73
  2 结果  73-76
    2.1 体外培养人输卵管上皮细胞倒置相差显微镜观察  73
    2.2 体外培养人输卵管上皮细胞角蛋白染色  73-76
    2.3 1α,25-(OH)_2D_3对人输卵管上皮细胞增殖(A_(490))的影响  76
  3 讨论  76-79
  本部分小结  79-80
  参考文献  80-83
第四部分 1α,25-(OH)_2D_3对人输卵管上皮细胞VDR、CaBP-D28k表达的影响  83-104
  1 材料与方法  83-93
    1.1 人输卵管组织来源  83
    1.2 主要实验仪器与设备  83-84
    1.3 主要实验试剂  84
    1.4 主要溶液的配制  84-87
    1.5 实验方法  87-93
    1.6 统计字分析  93
  2 结果  93-96
    2.1 不同浓度1α,25-(OH)_2D_3对人输卵管上皮细胞VDR、CaBP-D28k mRNA表达的影响  93-94
    2.2 10~(-7)mol/L 1α,25-(OH)_2D_3处理不同时间对人输卵管上皮细胞VDR、CaBP-D28k mRNA表达的影响  94-95
    2.3 10~(-7)mol/L 1α,25-(OH)_2D_3处理不同时间对人输卵管上皮细胞VDR、CaBP-D28k蛋白表达的影响  95-96
  3 讨论  96-98
  本部分小结  98-99
  图版  99-101
  参考文献  101-104
全文结论  104-105
附录Ⅰ 主要英文缩略词表  105-107
附录Ⅱ 在学期间发表论文清单  107-108
附录Ⅲ 科技查新报告  108-120
致谢  120

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中图分类: > 医药、卫生 > 妇产科学 > 产科学 > 病理妊娠（异常妊娠） > 异位妊娠（子宫外孕）
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