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SIRT1调节EZH2的表达并且影响PcG对靶基因SATB1的转录调控

作　者: 陆璐
导　师: 梁植权；刘德培；吕湘
学　校: 北京协和医学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: SIRT PcG SATB1 EZH2 靶基因组蛋白转录调控转录因子启动子区甲基化酶染色质构象北京协和医学院基因表达模式表观遗传哺乳动物 RNA 免疫共沉淀 histone 基因组的位点
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

Polycomb group (PcG)家族是在进化上从果蝇到人都十分保守的蛋白家族,因其在发育等过程中的重要作用而被广泛研究。PcG家族对于发育过程中体轴的形成,神经生成和造血生成都至关重要,而在哺乳动物的干细胞中研究证实PcG家族参与维持干细胞的多能性状态。在哺乳动物小鼠和人的胚胎来源的细胞中进行的大规模芯片筛查发现了上千个PcG家族蛋白的下游基因,包括发育过程中上游的转录因子和一些重要的细胞信号通路分子。已有的研究表明,PcG对下游基因的作用是基于其对组蛋白进行的修饰导致的染色质高级结构的改变,从而维持基因的沉默状态。PcG家族中唯一具有组蛋白甲基转移酶活性的分子是EZH2,它与EED、Suzl2共同组成PRC2复合物,特异性修饰H3K27。SIRT1 (Sirtuin 1)是人类的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶,催化作用为NAD+依赖。研究表明,哺乳动物中,SIRT1在能量限制和其它的刺激作用下,可以增加基因组的稳定性,协调细胞对刺激的反应,增加能量产生和利用,促进细胞的修复和防御,延长细胞的生存时间。SIRT1可以与多种重要的转录因子和转录辅助因子相互作用实现其功能的,这些转录因子包括MyoD、p300、PGC-1α、PPARγ、NF-κB、Ku70、p53及FOXO等。SIRT1还被报道和HIC1相互作用而结合在基因的启动子区,而形成对SIRT1自身转录的负调控。此外,在果蝇和人类的癌细胞中都发现了SIRT1和EZH2之间的间接结合,而这种结合可能会影响PcG对组蛋白底物的偏好性。那么SIRT1是否可以通过其他的途径影响PcG的功能呢?我们利用RNA干扰技术,在细胞中敲低SIRT1的表达水平,进而检测EZH2及其下游靶基因的表达水平。SATB1是在文献芯片数据报道的PcG的下游基因,我们在实验中进一步验证了SATB1是EZH2的直接下游。因此我们选择了经典的EZH2靶基因HoxA9和本研究中通过实验确证的靶基因SATB1作为检测对象。除检测转录水平外,我们还通过染色质免疫沉淀检测了SATB1和HoxA9上特异的组蛋白修饰以及修饰酶的结合状态。结果显示,SIRT1干扰的细胞中,EZH2蛋白水平升高,而SATB1和HoxA9转录水平降低,同时伴随着H3K27me3和EZH2在启动子区富集的增加。同时,我们也检测了SATB1和HoxA9启动子区SIRT1特异的组蛋白底物H4K16Ac的修饰状态以及SIRT1蛋白的结合,结果显示,H4K16Ac基本没有变化,同时我们也没有检测到SIRT1在这两个启动子的结合。表明Sirtl对SATB1和HoxA9的调控作用不是直接的,而是与其对EZH2表达的影响密切相关。进一步对机制的探讨显示,SIRT1干扰的细胞中,EZH2并没有发生转录水平的改变,而是增加了EZH2蛋白的稳定性。综上所述,我们首先用实验确证了SATB1在HeLa细胞中是EZH2的直接下游基因,然后我们发现在SIRT1干扰的细胞中,EZH2蛋白稳定性上升,以及PcG对下游底物SATB1和HoxA9抑制作用增强,而这种作用的增强不受到SIRT1组蛋白去乙酰化酶活性的直接调节。

全文目录

目录  3-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
前言  9-28
  1. 表观遗传是基因表达的重要调控方式  9-13
    1.1 表观遗传研究的起源  9-10
    1.2 在多个物种中的表观遗传研究进展  10-11
    1.3 表观遗传对多细胞生物的细胞分化很重要  11
    1.4 表观遗传研究的方向  11-13
  2. 组蛋白修饰的种类及其功能研究  13-19
    2.1 组蛋白的磷酸化修饰  14
    2.2 组蛋白的乙酰化修饰  14-16
    2.3 组蛋白的甲基化修饰  16-19
  3. H3K27甲基化及H3K27特异的甲基转移酶EZH2  19-24
    3.1 H3K27甲基化修饰的生理意义  19-20
    3.2 Polycomb Group蛋白家族通过组蛋白修饰引起的染色质高级结构改变实现对下游基因的沉默作用  20-23
    3.3 EZH2与Ⅲ类HDAC的相互作用  23
    3.4 芯片结果提示SATB1是PcG的靶基因  23-24
  4. 组蛋白去乙酰化酶SIRT1及其底物H4K16Ac  24-27
    4.1 SIRT1是一个功能多样的调节蛋白  24-25
    4.2 SIRT1是组蛋白去乙酰化酶  25-26
    4.3 SIRT1特异的组蛋白修饰位点H4K16Ac的功能  26-27
  5. 本研究提出的主要科学间题和研究内容  27-28
材料与方法  28-51
  一、实验材料  28-30
    1. 实验用细胞系、菌株和质粒  28
    2. 限制性内切酶及其他修饰酶  28
    3. 抗体  28-29
    4. 其它主要试剂及试剂盒  29
    5. 主要仪器设备  29-30
  二、实验方法  30-51
    1. 基本技术路线  30
    2. HeLa、293等细胞的培养  30-31
    3. 非病毒方法介导的哺乳动物细胞转染  31-32
    4. 逆转录病毒的包装和靶细胞的感染  32-34
    5. 转染后或者逆转录病毒感染后细胞的筛选和克隆细胞株的获得  34
    6. 腺病毒表达载体的构建、包装及靶细胞的感染  34-37
    7. 双荧光素酶报告系统的检测  37-38
    8. 荧光实时定量PCR检测基因表达  38-41
    9. DNA甲基化修饰抑制剂及Ⅰ/Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理细胞  41
    10. 亚细胞组分蛋白样品的制备  41-42
    11. 蛋白质免疫共沉淀检测蛋白质修饰状态  42-43
    12. 染色质免疫共沉淀检测染色质上调控因子的结合和组蛋白的修饰  43-47
    13. Western Blot  47-51
实验结果  51-71
  1. SATB1是典型的EZH2靶基因  51-57
    1.1 DNA甲基化修饰抑制剂可以诱导SATB1表达  51-52
    1.2 Ⅰ/Ⅱ类HDAC抑制剂TSA可以上调SATB1表达  52-53
    1.3 过表达EZH2可以下调SATB1的表达  53-54
    1.4 RNA干扰EZH2可以上调SATB1的表达  54-55
    1.5 染色质免疫共沉淀检测到SATBI近端启动子区存在EZHZ的结合和H32K7m3e的富集  55-57
  2. SIRT1干扰升高EZH2的蛋白水平和增强PcG对下游靶基因SATB1和HoxA9的沉默作用  57-65
    2.1 RNA干扰SIRT1的细胞中EZH2蛋白水平升高  57-58
    2.2 RNA干扰SIRT1的细胞中胞浆可溶和染色质结合部分的EZH2水平都上调  58-59
    2.3 SIRT1干扰的细胞内总体的H4K16Ac水平上升而H3K27me3保持不变  59
    2.4 SIRT1干扰的细胞中PcG靶基因SATB1和HoxA9转录水平改变  59-60
    2.5 SIRT1干扰的细胞中H3K27me3和EZH2在SATB1和HoxA9的近端启动子区富集程度增加  60-62
    2.6 SIRT1干扰的细胞中SATB1和HoxA9的近端启动子区H4K16Ac不改变  62-64
    2.7 SIRT1干扰的细胞中H4 Ac和H3 Ac的改变  64-65
  3. SIRT1不能在转录水平上调节EZH2表达,而SIRT1干扰的细胞中EZH2蛋白稳定性增加  65-71
    3.1 SIRT1干扰的细胞中EZH2启动子报告基因的检测  65-67
    3.2 SIRT1干扰的细胞中EZH2成熟的mRNA水平不改变  67
    3.3 SIRT1在EZH2的启动子区没有检测到结合  67-68
    3.4 SIRT1干扰的细胞中EZH2蛋白的稳定性增强  68-70
    3.5 EZH2蛋白上没有检测到乙酰化修饰  70-71
讨论  71-79
  1. SIRT1可能通过间接途径调节EZH2的表达并影响其下游基因  71-73
  2. EZH2可能通过对SATB1的调节参与淋巴细胞以及红系的分化过程  73-74
  3. SIRT1不直接通过对组蛋白的去乙酰化作用调节SATB1和HoxA9  74-75
  4. SIRT1对EZH2的调节作用增加了PcG下游基因SATB1和HoxA9调控方式的多样性  75-76
  5. SIRT1对EZH2的调节作用可能与后者在肿瘤细胞中的过度表达相关  76-79
参考文献  79-89
小结  89-90
非论文综述  90-107
  参考文献  99-107
致谢  107-108
个人简历  108-110

SIRT1调节EZH2的表达并且影响PcG对靶基因SATB1的转录调控

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