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Daintain在巨噬细胞RAW264.7中的功能研究

作　者: 颜冬菁
导　师: 陈正望
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: oaintain 17-β-雌二醇(E2) RAW264.7细胞 细胞增殖 细胞周期 吞饮能力 抗原递呈
分类号: Q26
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


Daintain(大炎肽)是20世纪90年代发现的新巨噬细胞因子,是IFN-γ诱导而产生,分子量17 kDa,定位于胞浆,具有钙离子结合能力的炎症支架蛋白。Daintain基因定位于人6号染色体组织相容复合体Ⅲ(MHCⅢ)区,MHCⅢ含有多种与免疫应答相关的基因,暗示Daintain在免疫应答中发挥重要作用。目前关于Daintain在体内的生理功能还未研究清楚,但是研究发现其参与多种炎症疾病的发生和发展,包括器官移植排斥,中枢神经系统损伤和多种自身免疫性疾病等,可以肯定Daintain在单核巨噬细胞发挥免疫应答过程中起重要的作用。17-β-雌二醇(E2)是一个重要的免疫调节剂,调节多种细胞因子的表达。但E2对Daintain表达的调节作用未有报道。本文首先以巨噬细胞系RAW264.7为模型,探讨E2对Daintain的调节作用及可能的分子机制,已取得主要研究成果如下：1)通过RT-PCR和Western Blot方法检测E2对Daintain的调节作用,在生理浓度范围(10-10M-10-7M)的E2能显著上调Daintain mRNA和蛋白水平的表达,且在10-10M-10-8M内是剂量依赖性的调节方式。虽然E2在10-7M浓度时诱导Daintain的表达量比10-8M低,但是仍高于对照组。2) RAW264.7细胞组成性地表达有功能性的雌激素受体α(ERα),不表达雌激素受体β(ERβ)。雌激素受体抑制剂ICI 182780能抑制E2诱导的Daintain的表达,说明ERα参与到这个过程中。3)LPS单独或者与E2协同对Daintain的表达无调节作用,暗示Daintain直接由激素调控表达,与一般的炎症因子不同。4)提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,成功构建含有Daintain基因启动子的荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic-DT(-1572_+59)。进一步通过酶切pGL3-Basic-DT(-1572_+59),回收载体、连接,成功构建载体pGL3-Basic-DT(-1286_+59), pGL3-Basic-DT(-794_+59)和pGL3-Basic-DT(-595_+59)。Daintain基因启动子的荧光素酶报告载体为进一步研究Daintain转录调控作用提供了载体资源。5)通过检测荧光素酶活性,发现E2对载体pGL3-Basic-DT(-1572_+59)具有激发活性。5’端剪切Daintain基因启动子后,发现E2对载体pGL3-Basic-DT(-1286_+59)活性最大,而对载体pGL3-Basic-DT(-794_+59)和pGL3-Basic-DT(-595_+59)没有活性。说明Daintain基因启动子区-1286 bp至+59 bp内含有E2调节的活性区域。Daintain组成性地表达于单核巨噬细胞中,但其对巨噬细胞功能的影响未研究清楚。本文第二部分研究过表达Daintain对RAW264.7细胞增殖和细胞周期的影响,及其对LPS诱导RAW264.7细胞的吞饮能力和抗原递呈表型变化的影响。已取得的主要研究结果如下：1)成功建立真核稳定转染过表达Daintain的RAW264.7细胞株。2)发现过表达Daintain促进RAW264.7细胞更多的进入S期,G1期细胞减少,进而加快细胞周期,促进细胞增殖。3)发现过表达Daintain可能通过促进LPS诱导RAW264.7细胞中NF-KB活性的增强,进而促进LPS诱导RAW264.7细胞的吞饮能力,以及促进LPS诱导RAW264.7细胞向树突状细胞形态的分化,促进表面抗原分子MHCⅡ和CD86的上膜量。以上研究表明E2对通过调节基因启动子活性来调节Daintain的表达；Daintain促进RAW264.7细胞增殖,吞饮以及向树突状细胞分化的潜能。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
1 绪论  11-38
  1.1 Daintain的研究进展  11-23
  1.2 性别与自身免疫性疾病  23-27
  1.3 雌激素受体通路  27-33
  1.4 巨噬细胞概述  33-36
  1.5 本研究的目的与意义  36-38
2 17-β-雌二醇对Daintain调节作用的研究  38-71
  2.1 引言  38-39
  2.2 材料与仪器  39-41
  2.3 溶液系统  41-43
  2.4 实验方法  43-52
  2.5 结果与分析  52-67
  2.6 小结  67
  2.7 讨论  67-71
3 过表达Daintain对巨噬细胞系RAW264.7功能的影响  71-88
  3.1 引言  71
  3.2 材料与仪器  71-72
  3.3 溶液系统  72-73
  3.4 实验方法  73-76
  3.5 结果与分析  76-85
  3.6 小结  85
  3.7 讨论  85-88
4 全文总结  88-91
  4.1 主要研究结果  88-89
  4.2 创新点  89-90
  4.3 有待进一步研究的工作  90-91
致谢  91-93
参考文献  93-112
附录1 攻读博士学位期间发表的文章  112-113
附录2 主要英文缩略词表  113-114
附录3 小鼠与人Daintain蛋白序列比对图  114-115
附录4 pGL3-Basic-DT(-1572_+59)测序彩图  115-116
附录5 pGL3-Basic-DT(-1286_+59)测序彩图  116-117
附录6 pGL3-Basic-DT(-794_+59)测序彩图  117-118
附录7 pGL3-Basic-DT(-595_+59)测序彩图  118

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中图分类: > 生物科学 > 细胞生物学 > 细胞生物化学
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