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油茶蒲减肥降脂功能因子研究

作　者: 陈秋平
导　师: 张英；沈建福
学　校: 浙江大学
专　业: 食品科学
关键词: 油茶蒲肥胖脂肪酸合酶 3-O-甲基鞣花酸-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖鞣花酸没食子酸脂肪细胞安全性评价
分类号: R151
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

油茶(Camellia oleifera Abel.)是我国重要的木本油料作物,在我国有一千多年的种植历史。山茶油富含不饱和脂肪酸,具有很高的营养价值,被誉为“东方橄榄油”。油茶蒲为油茶果的外种皮,占油茶果湿重的60%,但是目前利用率极低。本论文对油茶蒲中的活性物质进行分离鉴定,并对其减肥降脂作用进行系统研究。主要研究结论如下：(1)用50%的乙醇-水溶液热回流提取得到油茶蒲提取物(OCE),采用高速逆流色谱直接从油茶蒲提取物中分离制备获得3个化合物单体,通过红外光谱、紫外光谱、质谱、核磁等技术鉴定其分别为没食子酸(GA)、鞣花酸(EA)和3-0-甲基鞣花酸-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖(MEAG)。(2)高效液相色谱测得OCE中GA、EA、MEAG的含量分别为3.67、3.20、5.58 mg/g。采用盐酸水解和大孔树脂吸附-解析法对OCE进行处理,酸水解产物中GA和EA含量分别为OCE的18倍和4倍,D101大孔树脂的40%乙醇洗脱物中MEAG的含量是OCE的2.7倍。(3)采用脂肪酸合酶(FAS)抑制的体外评价体系,测得OCE、EA和MEAG对FAS的半抑制浓度(IC50)分别为2.30、2.50和37.73μg/mL。FAS抑制动力学研究表明,OCE对底物A-CoA为竞争性抑制,对M-CoA、NADPH均为混合性(竞争性-非竞争性)抑制。EA和MEAG对M-CoA和NADPH的抑制类型均为混合性抑制和反竞争性抑制。对底物A-CoA而言,EA和MEAG分别为混合性抑制和竞争性抑制。表明EA和MEAG主要通过作用于酰基转移酶结构域,或特异性结合FAS-NADPH而使FAS失活。(4)采用3T3-L1前脂肪细胞增殖抑制试验,对油茶蒲中分离得到的活性化合物进行功能评价,表明GA能显著抑制前脂肪细胞增殖,250μM给药24 h,对前脂肪细胞的增殖抑制率达66.5%；’通过观察3T3-L1前脂肪细胞的分化,发现OCE、GA、EA及MEAG均对前脂肪细胞的分化有抑制作用,并能减少脂肪细胞中的甘油三酯(TG)含量；同时,发现MEAG有促进成熟脂肪细胞中脂肪分解的作用,10μM的剂量即能显著促进脂肪细胞释放甘油。(5)采用预防型小鼠肥胖试验模型,通过对高脂饲料喂养的小鼠分别给予100 mg/kg、200mg/kg、300 mg/kg OCE和100 mg/kg GA,结果显示：OCE对小鼠的减肥作用呈剂量依赖关系,100 mg/kg的OCE即能显著降低试验小鼠的体重增长率(P<0.05); 200 mg/kg OCE对血脂和体重有较全面的作用,能够显著降低小鼠血清TC、TG,提高HDL-C,降低附睾和肾周脂肪,提高肝脏中SOD的活性,降低肝脏中的FAS活性,减轻肝脏脂滴积累作用。100 mg/kgGA能显著降低小鼠体重增长率、血清中的TC含量,减少肾周脂肪,降低肝脏FAS活性和MDA含量,减轻肝脏脂滴积累作用,提高肝脏中SOD的活性。(6)采用治疗型小鼠肥胖试验模型,通过对肥胖小鼠分别灌胃100、200、400 mg/kg OCE和100 mg/kg GA,结果显示200 mg/kg、400 mg/kg OCE能显著减轻高脂膳食诱导的肥胖小鼠体重,分别在第24天和第10天与模型组达到显著性差异。400 mg/kg的OCE对肥胖小鼠表现出较全面的减肥降脂作用,能够显著降低肥胖小鼠体重以及血清中的TC、TG含量,降低肾周、附睾脂肪以及肝脏中的MDA含量和FAS活性。而100 mg/kg GA对肥胖小鼠的治疗效果不明显。(7)安全性评价试验表明,油茶蒲提取物油大、小鼠经口急性毒性最大耐受量(MTD)均大于20.0 g/kg体重,属无毒级。Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形实验结果均为阴性,表明油茶蒲提取物无致突变性。慢性毒性试验显示,经口给予大鼠0、0.5、1.0、2.0g/kg油茶蒲提取物30d,未见实验动物出现中毒症状,大体解剖及组织学观察未见异常病理改变,并且大鼠体重、进食量、食物利用率、血常规、血生化、脏体比等均无明显改变,表明油茶蒲提取物的大鼠30 d喂养试验,最大未观察到有害作用剂量(NOAEL)为2.0 g/kg体重。油茶蒲提取物在脂肪酸合酶抑制体系、前脂肪细胞分化体系、预防肥胖动物模型和肥胖动物治疗模型中均有显著表现,表明油茶蒲提取物能够有效改善血脂异常,对膳食诱导的肥胖具有良好的预防和治疗效果,并且安全毒性学试验表明它具有较高的安全性,是一种极具开发价值的资源。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-19
第一章概论  19-41
  1.1 油茶  19-23
    1.1.1 油茶简介  19
    1.1.2 山茶油及其组成  19-20
    1.1.3 油茶化学成分及功能研究  20-22
    1.1.4 油茶产业的发展状况  22-23
  1.2 肥胖症与脂质代谢异常  23-25
    1.2.1 超重与肥胖的全球化趋势  24-25
    1.2.2 肥胖相关疾病  25
  1.3 减肥措施与方法研究  25-28
    1.3.1 节食  25-26
    1.3.2 运动  26
    1.3.3 手术  26-27
    1.3.4 减肥药物概况  27-28
  1.4 减肥药的发展方向  28-38
    1.4.1 抑制脂肪的吸收  29
    1.4.2 降低食欲,影响能量摄入  29-30
    1.4.3 增加能量消耗  30
    1.4.4 抑制脂肪合成  30-35
    1.4.5 抑制前脂肪细胞的增殖和分化,促进脂肪分解  35-38
  1.5 本课题的目的与意义  38-41
第二章油茶蒲有效成分的分离纯化制备与结构鉴定  41-57
  2.1 引言  41
  2.2 材料与方法  41-46
    2.2.1 材料、试剂和仪器  41-42
    2.2.2 油茶蒲提取物的制备  42-43
    2.2.3 福林酚法测定多酚含量  43
    2.2.4 大孔树脂精制油茶蒲提取物  43-44
    2.2.5 高速逆流色谱分离体系的摸索  44
    2.2.6 高速逆流色谱分离条件的优化  44
    2.2.7 高速逆流色谱制备油茶蒲有效成分  44-45
    2.2.8 特征性化合物的结构鉴定  45
    2.2.9 高效液相色谱分析油茶蒲提取物  45-46
    2.2.10 油茶蒲提取物的酸水解  46
    2.2.11 实验数据处理  46
  2.3 结果与分析  46-54
    2.3.1 油茶蒲提取物的HPLC分析  46-47
    2.3.2 油茶蒲提取物大孔树脂分级洗脱相的成分分析  47-48
    2.3.3 高速逆流色谱分离体系的选择及条件的优化  48-50
    2.3.4 高速逆流色谱分离油茶蒲提取物  50-52
    2.3.5 特征性化合物的结构鉴定  52-54
    2.3.6 油茶蒲提取物中特征性成分定量分析  54
  2.4 讨论  54-55
  2.5 小结  55-57
第三章油茶蒲提取物及其特征性成分对FAS的抑制作用  57-69
  3.1 引言  57
  3.2 材料与方法  57-59
    3.2.1 材料、试剂和仪器  57-58
    3.2.2 FAS反应活性的测定与计算  58-59
    3.2.3 FAS抑制活性的测定  59
    3.2.4 油茶蒲活性部位对脂肪酸合酶的抑制作用  59
    3.2.5 实验数据处理  59
  3.3 结果与分析  59-66
    3.3.1 油茶蒲提取物(OCE)对FAS抑制的可逆抑制  59-61
    3.3.2 大孔树脂分级部位对FAS的抑制作用  61-62
    3.3.3 油茶蒲特征性成分对FAS的抑制作用  62-65
    3.3.4 油茶蒲的有效活性部位  65-66
  3.4 讨论  66-68
  3.5 小结  68-69
第四章油茶蒲提取物及其特征性成分对脂肪细胞的作用  69-81
  4.1 引言  69
  4.2 材料与方法  69-73
    4.2.1 试验材料  69
    4.2.2 试剂  69-70
    4.2.3 仪器  70
    4.2.4 试剂的配制  70-71
    4.2.5 细胞培养方法  71
    4.2.6 MTT法测定对前脂肪细胞增殖的作用  71-72
    4.2.7 前脂肪细胞分化方法  72
    4.2.8 油红O染色方法  72-73
    4.2.9 甘油三酯含量测定  73
    4.2.10 脂肪分解  73
    4.2.11 实验数据处理  73
  4.3 结果与分析  73-79
    4.3.1 MTT法测定没食子酸对3T3-L1前脂肪细胞的增殖抑制作用  73-74
    4.3.2 油红染色法测定油茶蒲提取物对3T3-L1前脂肪细胞分化的作用  74-77
    4.3.3 OCE及其特征性成分对脂肪细胞内甘油三酯含量的影响  77-78
    4.3.4 MEAG对脂肪细胞内脂肪的分解作用  78-79
  4.4 讨论  79-80
  4.5 小结  80-81
第五章油茶蒲提取物对小鼠高脂膳食诱导肥胖的预防作用  81-93
  5.1 引言  81
  5.2 材料、试剂与方法  81-84
    5.2.1 试剂与材料  81-82
    5.2.2 仪器与设备  82
    5.2.3 小鼠预防性肥胖试验  82-83
    5.2.4 实验小鼠血脂的测定  83
    5.2.5 实验小鼠肝脏中FAS活性的测定  83-84
    5.2.6 实验小鼠肝脏中抗氧化水平的测定  84
    5.2.7 实验小鼠肝脏切片的制作  84
    5.2.8 实验数据处理  84
  5.3 结果与分析  84-89
    5.3.1 OCE和GA对实验小鼠体重的影响  84-85
    5.3.2 OCE和GA对实验小鼠脏器的影响  85-86
    5.3.3 OCE和GA对实验小鼠血脂的影响  86-87
    5.3.4 OCE和GA对实验小鼠体脂的影响  87
    5.3.5 OCE和GA对实验小鼠肝脏脂肪的影响  87-88
    5.3.6 OCE和GA对实验小鼠肝脏抗氧化水平的影响  88-89
  5.4 讨论  89-90
  5.5 小结  90-93
第六章油茶蒲提取物对高脂膳食诱导小鼠肥胖的治疗作用  93-105
  6.1 引言  93
  6.2 材料、试剂与方法  93-96
    6.2.1 试剂与材料  93-94
    6.2.2 仪器与设备  94
    6.2.3 小鼠治疗型肥胖模型试验  94-95
    6.2.4 实验小鼠血脂的测定  95
    6.2.5 实验小鼠肝脏中FAS活性的测定  95
    6.2.6 实验小鼠肝脏中抗氧化水平的测定  95
    6.2.7 实验小鼠肝脏切片的制作  95-96
    6.2.8 实验数据处理  96
  6.3 结果与分析  96-101
    6.3.1 高脂膳食的肥胖造模  96
    6.3.2 OCE和GA对实验小鼠体重的影响  96-98
    6.3.3 OCE和GA对实验小鼠脏器的影响  98
    6.3.4 OCE和GA对实验小鼠血脂的影响  98-99
    6.3.5 OCE和GA对实验小鼠体脂的影响  99
    6.3.6 OCE和GA对实验小鼠肝脏脂肪的影响  99-100
    6.3.7 OCE和GA对实验小鼠肝脏抗氧化水平的影响  100-101
  6.4 讨论  101-102
  6.5 小结  102-105
第七章油茶蒲提取物的安全性评价  105-121
  7.1 引言  105
  7.2 材料、试剂与方法  105-108
    7.2.1 材料与试剂  105-106
    7.2.2 大鼠急性经口毒性试验  106
    7.2.3 小鼠急性经口毒性试验  106
    7.2.4 Ames试验  106-107
    7.2.5 小鼠骨髓细胞微核试验  107
    7.2.6 小鼠精子畸形试验  107
    7.2.7 大鼠30天喂养试验  107-108
    7.2.8 数据处理  108
  7.3 结果与分析  108-118
    7.3.1 大鼠急性经口毒性试验  108-109
    7.3.2 小鼠急性经口毒性试验  109
    7.3.3 Ames试验  109-112
    7.3.5 小鼠精子畸形试验  112-113
    7.3.6 大鼠30天喂养试验  113-118
  7.4 讨论  118-119
  7.5 小结  119-121
第八章总结与展望  121-125
  8.1 总结  121-123
  8.2 展望  123-125
参考文献  125-137
附录  137-149
攻读博士期间主要的科研成果  149-151
致谢  151

油茶蒲减肥降脂功能因子研究

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