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Intermedin心血管保护作用及其机制的研究

作　者: 杜秋香
导　师: 王英元
学　校: 山西医科大学
专　业: 法医病理学
关键词: 法医病理学 中介素 心肌缺血 心肌缺血再灌注 细胞培养
分类号: R541
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


缺血性心脏病（IHD）已经成为西方国家人口死亡的重要原因,在我国已经上升至人口死亡原因的第二位,同时这也是法医学心源性猝死（SCD）的主要原因,阐明心源性猝死的过程和机制不仅有助于了解法医学猝死的病理机制和鉴定,也有助于预防医学和临床医学对缺血性心脏病（IHD）的防治。目的:本研究通过制作大鼠心肌缺血和缺血再灌注模型,观察急性心肌缺血（AMI）和缺血再灌注（I/R）诱发的的心肌损伤的变化,探讨中介素（Intermedin,IMD）对急性心肌缺血和缺血再灌注诱发的心肌损伤的作用及其机制。方法:本实验分动物实验和培养细胞两部分进行研究。1.以健康雄性SD大鼠（体重250-300g）随机分为①对照组（N）:只开胸不做任何处理,1.5h后处死;②缺血组（I）:缺血1.5h后处死;③IMD预处理缺血组（I+D）:缺血前30min股静脉注射给予IMD10-7mol/L,缺血1.5h后处死;④缺血再灌注组（I/R）:缺血1h再灌注30min后处死;⑤IMD预处理缺血再灌注组（I/R+D）:缺血前30min股静脉注射给予IMD10-7mol/L,然后缺血1h再灌注30min后处死。每只动物全程心电图监护检测动物模型制作是否成功。实验一:测量心脏收缩及舒张功能,包括平均动脉血压（MABP）、心率（HR）、左室收缩末期压（LVSP）、左室舒张末期压（LVDP）、左室等容收缩/舒张期压力上升或下降最大速率（±LVdp/dtmax）等;测定血清中LDH活性,缺血心肌组织中MDA含量和SOD活性;通过HE染色和电镜观察缺血区心肌细胞形态变化,免疫组织化学法检测凋亡相关基因Bcl-2/Bax蛋白表达变化。每种方法每组动物6例。实验二:用实时荧光定量PCR方法检测IMD受体系统（CRLR/RAMPs）mRNA表达变化,ELISA方法检测心肌组织cAMP和cGMP含量变化,酶化学法检测NO浓度和NOS活力。2.取生长良好的H9c2心肌细胞采用化学缺氧法,使用氧清除剂连二亚硫酸钠（Na2S2O4）建立缺氧和缺氧复氧模型。随机分为5组:（1）正常组:心肌细胞按正常条件培养;（2）缺氧组:用缺氧液置换正常培养液,细胞培养箱中孵育1.5小时;（3）缺氧IMD预处理组:缺氧前30min加入IMD10-7mol/L,用缺氧液置换正常培养液孵育1.5小时;（4）缺氧-复氧组:将细胞按照上述模型复制方法缺氧30min复氧1h;（5）缺氧-复氧IMD预处理组:缺氧前30min加入IMD10-7mol/L,然后同缺氧-复氧组缺氧30min复氧1h。实验一:IMD对培养心肌细胞模拟缺血和缺血再灌注损伤的作用,用MTT比色法测细胞活力,检测细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活力,细胞中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力,透射电镜观察细胞超微结构,激光共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+相对浓度变化,流式细胞术测细胞凋亡率。实验二:通过实时荧光定量PCR方法检测IMD受体系统（CRLR/RAMPs）mRNA表达变化,ELISA方法检测心肌组织cAMP、PKA和cGMP含量变化,酶化学法检测NO浓度和NOS活力。结果:1.①缺血组和缺血再灌注组的左室收缩末期压（LVSP）低于对照组,左室舒张末期压（LVDP）高于对照组,两组比较有统计学差异（P<0.05orP<0.01）;IMD预处理升高了LVSP,降低了LVDP（P<0.05orP<0.01）。缺血组和缺血再灌注组的左心室内压最大上升速率、最大下降速率（±dp/dtmax）低于对照组,两组比较有统计学差异（P<0.05orP<0.01）;IMD预处理组±dp/dtmax均高于相应的缺血组和缺血再灌注组,有统计学差异（P<0.05orP<0.01）。各组对收缩压、舒张压、心率无明显影响。②缺血造成心肌损伤,LDH活性和MDA生成比对照组平均升高了60%和140%,SOD活性平均下降了50%,静脉给予IMD与单纯缺血组比较,LDH活性、MDA生成分别平均降低了18%和48%,SOD活性平均升高了24%。I/R导致严重心肌损伤,LDH活性和MDA生成比对照组平均升高了87%和189%,SOD活性平均下降了84%,静脉给予IMD与单纯I/R组比较,LDH漏出、MDA生成都平均降低了41%,SOD活性平均升高了38%（均P<0.01）。③急性心肌缺血和缺血再灌注引起的心肌细胞损伤在普通HE染色没有非常特异的表现,电镜可见缺血心肌组织线粒体结构尚存,嵴紊乱消失,粗面内质网脱颗粒,缺血再灌注心肌组织线粒体嵴紊乱甚至消失溶解成空泡,粗面内质网脱颗粒,肌纤维结构破坏,血管内皮细胞增生,核固缩。给予IMD预处理明显改善损伤引起的心肌细胞超微结构变化,线粒体损伤减轻,粗面内质网脱颗粒减少,心肌纤维结构完整。④缺血组和缺血再灌注心肌细胞内Bcl-2和Bax蛋白表达均高于对照组,但是Bcl-2与Bax平均光密度比值降低。IMD预处理组比损伤组Bcl-2蛋白表达显著升高,而Bax蛋白表达降低,导致Bcl-2与Bax平均光密度比值升高。2.①实时荧光定量PCR结果显示,以对照组作为参照,缺血组和缺血再灌注组心室肌CRLR、RAMP1/2/3的mRNA水平均明显上调（n=6,P<0.05orP<0.01）,IMD预处理组四种受体mRNA相对表达比单纯缺血组和缺血再灌注组更高（n=6,P<0.05orP<0.01）。②ELISA:与对照组相比,单纯缺血组cAMP含量升高,是对照组的1.30倍,IMD预处理缺血组显著升高心肌组织cAMP含量,是对照组的2.87倍,缺血组的2.2倍（n=6,均P<0.05）,单纯I/R组cAMP含量升高,是对照组的1.36倍,IMD预处理I/R组显著升高心肌组织cAMP含量,是对照组的2.9倍,I/R组的2.06倍（均P<0.05）。与对照组相比,单纯缺血组cGMP含量升高,是对照组的1.63倍,IMD预处理缺血组心肌组织cGMP含量升高,是对照组的1.87倍,缺血组的1.14倍（n=6,均P<0.05）,单纯I/R组cGMP含量升高,是对照组的1.94倍,IMD预处理I/R组心肌组织cGMP含量升高,是对照组的2.27倍,I/R组的1.17倍（均P<0.05）。③缺血和缺血再灌注组心肌组织中一氧化氮（NO）含量和总一氧化氮合酶（TNOS）活力比对照组明显降低（P<0.01）,IMD预处理升高组织中一氧化氮（NO）含量和总一氧化氮合酶（TNOS）活力（P<0.05）,IMD预处理缺血再灌注组比IMD预处理缺血组升高更明显;但是缺血和缺血再灌注组心肌组织中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活力比对照组明显升高（P<0.05）,IMD预处理降低损伤组诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活力（P<0.05）,不过IMD对两种损伤降低诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活力的作用没有差别。3.①缺氧组和缺氧复氧组细胞存活率比对照组明显降低（p<0.01）,IMD处理组明显升高细胞存活率（p<0.01）。缺氧组和缺氧复氧组细胞培养液中LDH含量、细胞中MDA含量显著升高,SOD活力降低（P<0.01）,IMD预处理降低了LDH和MDA含量,升高了SOD活力,二者与相应损伤组相比较有统计学意义（P<0.05）,IMD预处理的缺氧组和缺氧复氧组比较没有统计学意义。②心肌细胞超微结构:对照组细胞基本结构正常;缺氧组可见部分线粒体出现明显肿胀,内质网扩张等超微病理改变,部分细胞还可见少量线粒体溶解坏死、核固缩、异染色质边集等改变;缺氧复氧组大部分线粒体肿胀,嵴紊乱消失,甚至出现很多空泡,内质网脱颗粒,核固缩,出现多个核仁;IMD预处理缺氧组和IMD预处理缺氧复氧组损伤程度明显减轻,可见部分细胞线粒体轻度肿胀,内质网扩张程度较轻,其中缺氧复氧组改善更明显。③缺氧组细胞[Ca2+]i（荧光强度）比对照组明显升高,IMD预处理缺氧组细胞[Ca2+]i（荧光强度）比缺氧组降低。缺氧复氧组细胞[Ca2+]i（荧光强度）比对照组显著升高,IMD预处理缺氧复氧组细胞[Ca2+]i（荧光强度）比缺氧复氧组降低。④缺氧组和缺氧复氧组细胞凋亡率比对照组明显升高（p<0.01）,IMD预处理组细胞凋亡率比损伤组降低（p<0.05）。4.①实时荧光定量PCR结果显示,以对照组作为参照,四组心肌细胞CRLR、RAMP1/2的mRNA表达水平均明显下调（n=6,P<0.05orP<0.01）,只有RAMP3的mRNA表达升高。IMD预处理组四种受体mRNA相对表达比相应缺氧组和缺氧复氧组升高（n=6,P<0.05orP<0.01）②心肌细胞中cAMP和PKA含量在五个组之间没有差异,但是缺氧组和缺氧复氧组cGMP含量比对照组升高（P<0.05）,IMD预处理组cGMP含量比相应的缺氧组和缺氧复氧组升高（P<0.05）。③心肌细胞中NO含量和TNOS活力在缺氧组和缺氧复氧组比对照组降低,（P<0.05orP<0.01）,IMD预处理后NO含量TNOS活力比相应损伤组升高（P<0.05orP<0.01）,但是iNOS活力在五个组之间没有差别。结论:1.IMD对心肌缺血或者心肌缺血再灌注诱发的损伤有明显的保护作用。表现为改善心功能、减少心肌酶释出、减少过氧化物生成,提高抗氧化能力和有效降低心肌细胞凋亡率。2.IMD的心血管保护作用通过激活其受体和cAMP、NO等第二信使发挥作用。3.IMD对体外培养心肌细胞具有保护作用,提高细胞存活率,减轻钙超载,降低细胞凋亡率等。4.IMD对心肌细胞的保护作用可能与激活受体系统和NOS/NO/cGMP途径有关。

全文目录


缩略语表(Abbreviations)  7-9
摘要  9-13
Abstract  13-17
前言  17-19
第一章：I MD 对大鼠心肌缺血和缺血再灌注损伤的作用与机理研究  19-49
  实验一：I M D 对大鼠心肌缺血和缺血再灌注损伤的作用  19-33
    1.1 引言  19
    1.2 材料与方法  19-23
      1.2.1 实验材料  19-20
      1.2.2 实验方法  20-23
      1.2.3 统计学处理  23
    1.3 结果  23-30
      1.3.1 IMD 对心肌缺血和缺血再灌注损伤心脏功能的影响  23-24
      1.3.2 IMD 对血清LDH 含量的影响  24
      1.3.3 IMD 对心肌组织MDA 含量和SOD 活性的影响  24-25
      1.3.4 心肌形态学观察  25-28
      1.3.5 免疫组化染色结果分析  28-30
    1.4 讨论  30-33
  实验二：IMD 预处理保护作用的信号转导途径的研究  33-49
    2.1 引言  33-34
    2.2 材料与方法  34-40
      2.2.1 实验材料  34-35
      2.2.2 实验分组  35
      2.2.3 动物模型的制备  35
      2.2.4 real-time RT-PCR 实验部分  35-38
      2.2.5 ELISA 实验部分  38-39
      2.2.6 硝酸还原酶法测定NO ，分型法测定NOS  39-40
    2.3 统计分析  40
    2.4 结果  40-44
      2.4.1 总RNA 评价与鉴定结果  40
      2.4.2 RT - PCR 结果  40-41
      2.4.3 ELISA 结果  41-43
      2.4.4 酶化学法检测结果  43-44
    2.5 讨论  44-49
第二章 IMD 对培养大鼠心肌细胞模拟缺血和缺血再灌注损伤的作用及机制研究  49-75
  实验一：IMD 对体外培养心肌细胞缺氧和缺氧复氧损伤的作用  49-64
    1.1 引言  49
    1.2 材料与方法  49-53
      1.2.1 细胞培养和试剂配制  49-50
      1.2.2 试剂与仪器  50-51
      1.2.3 实验模型  51
      1.2.4 实验分组  51
      1.2.5 MTT 比色法检测心肌细胞活力  51-52
      1.2.6 细胞培养液乳酸脱氢酶（LDH）活力测定，细胞中 MDA 含量、SOD 活力测定  52
      1.2.7 心肌细胞形态观察  52
      1.2.8 心肌细胞[Ca~(2+)]i的测定  52-53
      1.2.9 流式细胞术心肌细胞凋亡检测  53
    1.3 统计分析  53
    1.4 结果  53-60
      1.4.1 MTT 比色法检测心肌细胞活力  53-54
      1.4.2 细胞培养液LDH 、细胞中MDA 、SOD 测定  54-55
      1.4.3 心肌细胞形态观察  55-57
      1.4.4 心肌细胞[Ca~(2+)]1的测定  57-58
      1.4.5 心肌细胞凋亡检测  58-60
    1.5 讨论  60-64
      1.5.1 心肌细胞缺氧和缺氧复氧模型制作.  60-61
      1.5.2 IMD 对心肌细胞缺氧和缺氧复氧损伤心肌细胞存活率的影响  61
      1.5.3 心肌细胞各损伤指标的选择与分析.  61-62
      1.5.4 钙超载引发细胞损伤的机制  62-63
      1.5.5 钙超载与心肌细胞损伤  63-64
      1.5.6 心肌细胞损伤引发凋亡  64
  实验二：I MD 对心肌细胞保护作用的信号转导途径的研究  64-75
    2.1 引言  64
    2.2 材料与方法  64-70
      2.2.1 细胞培养  64-65
      2.2.2 主要试剂及仪器  65-66
      2.2.3 实验模型  66
      2.2.4 实验分组  66
      2.2.5 实时荧光定量PCR 实验部分  66-69
      2.2.6 ELISA 实验部分  69-70
      2.2.7 硝酸还原酶法测定NO ，分型法测定NOS  70
    2.3 统计学分析  70-71
    2.4 结果  71-74
      2.4.1 real-time RT-PCR 实验部分结果  71-72
      2.4.2 ELISA 实验部分结果  72-73
      2.4.3 NOS、NO 检测结果  73-74
    2.5 讨论  74-75
小结  75-76
参考文献  76-84
Intermedin 与心血管功能研究进展  84-96
  1 IMD 的结构和分布  84-85
  2 IMD 对血压的影响  85-86
  3 IMD 对心脏的作用  86-87
  4 IMD 对血管的作用  87-88
  5 IMD 对疾病状态下心血管功能的调节  88
  6 IMD 的其他生物学效应  88-89
  7 IMD 的作用机制  89-91
  8 结语  91-92
  参考文献  92-96
个人简介  96-97
致谢  97

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