学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

拟南芥AtLrgB基因的进化分析与功能研究

作　者: 杨燕君
导　师: 朱睦元；王君晖
学　校: 浙江大学
专　业: 遗传学
关键词: lrgA lrgB 胞壁质水解酶调控因子 拟南芥 AtLrgB 叶绿体内外膜 同化物分配 叶片花斑 叶绿体发育 淀粉 蔗糖 基因融合
分类号: Q943.2
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
下　载: 81次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


细菌的lrgA/B和cidA/B操纵子编码胞壁质水解酶调控因子,在细菌的自我分解机制中起重要作用。拟南芥基因组中有一个细菌lrgB基因的同源基因,称之为AtLrgB.通过序列比对发现,拟南芥基因组中许多编码肽聚糖合成酶的基因是缺失的,因此拟南芥细胞中没有肽聚糖结构。同时,拟南芥中不存在编码胞壁质水解酶的基因,因此,AtLrgB基因在进化过程中功能发生了改变。本研究通过对AtLrgB突变体和过量表达体的表型观察和分析,阐述了AtLrgB基因在拟南芥生长发育中的功能。得到的主要结果如下：1.构建了AtLrgB-EGFP融合蛋白来分析AtLrgB蛋白的亚细胞定位。结果表明,AtLrgB蛋白位于叶绿体内膜上。同时,构建了PAtLrgB.GUS启动子报告株系。GUS的组织化学染色结果表明AtLrgB基因主要在拟南芥的地上部分表达,在根中不表达。并且,GUS的表达主要集中在幼嫩的组织中,在成熟叶片中其表达从叶尖到叶片基部逐渐消失,表明AtLrgB基因的启动子受到的调控类似于叶片从库到源转变的调控机制。对于AtLrgB基因在一个光周期内表达量的实时定量PCR检测结果表明,AtLrgB基因的表达受到昼夜节律的调控。2. T-DNA插入突变体atlrgB-1植株与AtLrgB-RNAi转基因植株都表现出浅绿的子叶和幼叶。当atlrgB-1突变体在培养基上生长到8天时,子叶的叶尖开始出现坏死,并且逐渐扩散,然后第一对真叶也出现坏死。将PAtLrgB:AtLrgB转入突变体中进行表型弥补实验,结果证明突变体的表型与AtLrgB基因的T-DNA插入直接相关。3.通过构建35S:AtLrgB表达载体,获得了AtLrgB过量表达的拟南芥转基因纯系。通过表型观察,发现AtLrgB基因的过量表达导致了植株叶片萎黄和生长迟缓。4.观察了野生型、atlrgB-1突变体和过量表达体叶片的叶绿体亚显微结构。突变体和过量表达体的叶肉细胞中,叶绿体的类囊体结构都表现出稀疏的现象。atlrgB-1突变体叶绿体中的淀粉粒比野生型中大,并且数量更多；而在过量表达体中,淀粉粒很少甚至消失。维管束鞘细胞中,atlrgB-1突变体的叶绿体基本正常,而过量表达体的叶绿体较小,并且类囊体结构很少。5.测定了野生型、atlrgB-1突变体和过量表达体叶片的淀粉含量。结果表明突变体在白天比野生型累积了更多的淀粉,而过量表达体的淀粉累积量很少。同时,还测定了三种植株中蔗糖的含量。白天,突变体叶片中的蔗糖含量始终低于野生型；夜晚,突变体蔗糖含量先发生了短暂的急剧增加,然后逐渐减少。对于过量表达体来说,白天叶片中的蔗糖含量基本与野生型相等,只是在光周期的最后阶段略高于野生型；夜晚时分叶片中的蔗糖含量始终低于野生型。6.研究了培养基中不同蔗糖浓度对于atlrgB-1突变体和AtLrgB基因过量表达体表型的影响。在2%蔗糖浓度培养基上生长的atlrgB-1突变体植株相较于1%蔗糖浓度培养基上生长的植株,其叶片坏死出现得迟,并且坏死区域较少。而过量表达体在2%蔗糖浓度培养基上生长时,表现出更严重的萎黄表型。同时,还发现外源的葡萄糖对于突变体与过量表达体的影响类似于蔗糖。这些结果说明突变体和过量表达体的异常表型与碳水化合物的可获得性是密切相关的。7、经序列查找和比对,发现AtLrgB的同源蛋白在细菌和植物中是广泛存在的。这些同源蛋白的LrgB结构域氨基酸序列比对结果表明,这一结构域在细菌和植物中是高度保守的。同时,将植物中同源基因的N端序列与原核生物的LrgA结构域进行了氨基酸序列的比对后发现,这些基因的N末端与原核生物的LrgA结构域具有相似性,尽管这种相似性比LrgB结构域低。比对结果表明,从原核生物到真核生物的进化过程中,LrgA和LrgB基因发生了基因融合。8.构建了35S:AtLrgB-Dl和35S:AtLrgB-D2过量表达体,表型观察结果表明,单个LrgA结构域与LrgB结构域过量表达体都表现出35S:AtLrgB过量表达体的萎黄表型。同时,构建了PAtLrgB:AtLrgB-D1和PAtLrgB:AtLrgB-D2表达载体来对突变体进行表型弥补实验。在突变体内回转入PAtLrgB:AtLrgB-D1和PAtLrgB:AtLrgB-D2都不能弥补突变体的表型,说明行使AtLrgB功能需要完整蛋白的存在。因此,原核生物的LrgA和LrgB很有可能进化为拟南芥AtLrgB蛋白的两个功能结构域。

全文目录


致谢  9-10
摘要  10-12
Abstract  12-15
第一章 文献综述  15-43
  前言  15
  1 植物中初级碳同化物的分配  15-27
    1.1 淀粉的合成与分解  15-20
    1.2 蔗糖的合成与转运  20-24
    1.3 植物中初级碳同化物的分配调控  24-27
  2 叶绿体内膜上代谢产物转运体的研究  27-37
    2.1 叶绿体内膜上的转运体  27-30
    2.2 新的质体代谢产物转运体的研究进展  30-36
    2.3 代谢产物转运体的进化分析  36-37
  3 细菌中lrgA/B基因的研究进展  37-40
    3.1 胞壁质水解酶与穿孔素  37-38
    3.2 金黄色葡萄球菌的lrgA/B基因  38-39
    3.3 细菌中的cid/lrg调控系统  39-40
  4 拟南芥中的LrgAB基因  40-41
    4.1 植物叶绿体中不存在细菌原有的裂解调控机制  40-41
    4.2 拟南芥中LrgAB基因具有新的功能  41
  5 本研究的内容和意义  41-43
第二章 拟南芥AtLrgB基因的亚细胞定位与表达模式  43-59
  1 材料和方法  43-53
    1.1 材料  43
    1.2 试剂和主要仪器  43
    1.3 序列分析与比对  43
    1.4 植物基因组DNA提取(CTAB法)  43-44
    1.5 大肠杆菌化学转化感受态细胞制备  44
    1.6 大肠杆菌化学转化方法  44-45
    1.7 质粒小提(碱裂解法)  45
    1.8 农杆菌电转化感受态细胞的制备及电转化  45-46
    1.9 基于Gateway技术的启动子表达载体的构建  46-48
    1.10 基于Gateway技术的35S:AtLrgB:GFP表达载体的构建  48-49
    1.11 拟南芥转基因及筛选  49-50
    1.12 GUS蛋白的组织化学染色  50
    1.13 植物总RNA提取  50-51
    1.14 实时定量PCR  51-53
  2 实验结果  53-57
    2.1 AtLrgB蛋白的初步分析  53
    2.2 AtLrgB蛋白的亚细胞定位  53-55
    2.3 AtLrgB基因的表达模式  55-57
  3 讨论  57-59
    3.1 AtLrgB蛋白定位在叶绿体内膜上  57
    3.2 AtLrgB基因在植株地上部分表达,并且其表达受到昼夜调节  57-59
第三章 AtLrgB突变体和过量表达体的表型分析  59-75
  1 材料和方法  59-66
    1.1 材料  59
    1.2 试剂和主要仪器  59
    1.3 T-DNA突变体验证  59-60
    1.4 植物总RNA的提取  60-61
    1.5 半定量RT-PCR  61-62
    1.6 基于Gateway技术的AtLrgB-RNAi载体的构建  62
    1.7 基于Gateway技术的35S:AtLrgB表达载体的构建  62
    1.8 PAtLrgB:AtLrgB表达载体的构建  62-63
    1.9 Northern blot  63-66
  2 实验结果  66-73
    2.1 AtLrgB突变体与AtLrgB-RNAi转基因株系的获得和表型分析  66-71
    2.2 AtLrgB基因过量表达体的获得和表型分析  71-73
  3 讨论  73-75
    3.1 AtLrgB基因是拟南芥正常生长所必需的  73
    3.2 AtLrgB基因过量表达对拟南芥生长发育造成严重影响  73-74
    3.3 AtLrgB基因的缺失或过量对于叶肉与叶脉发育的影响是不同的  74-75
第四章 AtLrgB基因的细胞学和生理学功能分析  75-93
  1 材料和方法  75-78
    1.1 材料  75
    1.2 试剂和主要仪器  75
    1.3 植物叶片的超薄切片  75-76
    1.4 淀粉碘-碘化钾染色和淀粉含量测定  76-77
    1.5 元素含量测定  77-78
    1.6 蔗糖含量的测定  78
    1.7 实时定量PCR  78
  2 实验结果  78-87
    2.1 突变体、过量表达体的叶绿体亚显微结构观察  78-81
    2.2 突变体、过量表达体的淀粉染色和淀粉含量测定  81-82
    2.3 突变体、过量表达体的元素含量测定  82-84
    2.4 突变体，过量表达体的蔗糖含量测定和外源糖处理  84-86
    2.5 突变体，过量表达体中淀粉合成限速酶AGPase亚基基因的表达  86-87
  3 讨论  87-93
    3.1 AtLrgB基因缺失或过量影响叶绿体的发育  87-88
    3.2 AtLrgB基因缺失或过量影响碳同化物的分配  88-89
    3.3 突变体和过量表达体中碳同化物分配的异常导致了不正常的叶片发育  89-91
    3.4 AtLrgB基因直接或间接地调控了碳同化物的分配  91-93
第五章 AtLrgB基因的进化分析  93-102
  1 材料和方法  93-94
    1.1 材料  93
    1.2 试剂和主要仪器  93
    1.3 序列分析与比对  93
    1.4 35S:AtLrgB-D1与35S:AtLrgB-D2表达载体的构建  93-94
    1.5 PAtLrgB:AtLrgB-D1与PAtLrgB:AtLrgB-D2表达载体的构建  94
  2 实验结果  94-99
    2.1 AtLrgB蛋白的氨基酸序列比对  94-97
    2.2 AtLrrg蛋白的结构域拆分、过量表达与表型弥补  97-99
  3 讨论  99-102
    3.1 LrgA基因与LrgB基因在进化过程中发生了基因融合  99-100
    3.2 LrgA结构域与LrgB结构域是AtLrgB不可缺少的部分,并且有可能形成复杂的多聚体结构  100-101
    3.3 AtLrgB基因从原核生物进化而来,在拟南芥中的功能发生了变化  101-102
第六章 总结与展望  102-105
参考文献  105-116
附录1:缩略词-中英文对照  116-117
附录2:培养基及抗生素母液配方和常用缓冲液配方  117-121
攻读博士期间发表文章  121

相似论文

  1. 马铃薯交联复合变性淀粉的制备研究,TS236.9
  2. 铝铵基阳离子淀粉的制备及其在造纸中的应用,TS727
  3. 应用基因组改组技术选育真菌α-淀粉酶高产菌株,TQ925
  4. 精白保胚发芽米淀粉特性研究,TS235.1
  5. 粳米脂肪含量的氮素效应及其与米粉理化特性的关系研究,S511.22
  6. 夜间温度对水稻弱势籽粒灌浆充实的作用机制研究,S511
  7. 水稻及拟南芥神经酰胺基因的克隆及突变体的鉴定,S511
  8. 嗜热菌几丁质结合域及其在酶固定化中应用的研究,Q814
  9. 灰霉菌侵染拟南芥过程中ACD5的功能分析,S432.1
  10. 施氮量对小麦籽粒淀粉粒粒度分布的调控效应研究,S512.1
  11. 不同产区烤烟淀粉含量分布特点及与烟叶香型和感官质量的关系,S572
  12. 稻米淀粉理化特性及分子结构与食味品质的关系,S511
  13. 小麦麸皮中蛋白质、淀粉的分离技术研究,S512.1
  14. 小麦抗性淀粉含量的差异及其与面粉品质的关系,S512.1
  15. 水稻弱势籽粒昼夜灌浆充实的化学调控生理机制研究,S511
  16. 富士苹果MdCBF1基因的功能分析,S661.1
  17. 猪白细胞介素2/6嵌合基因的融合表达及活性研究,S858.28
  18. 马链球菌兽疫亚种全菌结合类M蛋白亚单位灭活疫苗的研制,S858.28
  19. 木薯淀粉—瓜尔胶复合膜的制备及性能研究,TS236.9
  20. 亚麻籽胶对玉米淀粉糊化和老化特性的影响以及在乳化肠中的应用,TS231
  21. 一株抗药用白菊枯萎病生防菌的分离与生防效应研究,S435.672

中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
© 2012 www.xueweilunwen.com