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虎杖(Polygonum Cuspidatum Sieb et zucc)是蓼科萝属多年生草本植物,是常用的中药,主产地为华东、甘肃、四川、云南等地。虎杖提取物具有多种功能作用,主要有抗炎、预防心血管疾病等药理活性,而其主要活性成分则是白藜芦醇(resveratrol)和大黄素(emodin)。作为植保素的白藜芦醇,不仅能显著提高植物体对紫外线、真菌等伤害的抵御能力,还对心血管系统起着保护作用。本研究以虎杖的幼嫩茎段为外植体,以其诱导出的愈伤组织为材料,通过照射紫外线后暗培养处理、外加H202以及H202淬灭剂,研究了愈伤组织的生长和白藜芦醇含量的变化,并通过半定量RT-PCR扩增探讨了RS基因表达水平的状况。主要研究结果如下：1.不同紫外线照射和不同取样时间对虎杖愈伤组织中H2O2含量的影响经过不同时间紫外线照射后,暗培养愈伤组织,培养时间1-5h的愈伤组织H202的含量总体变化趋势是先增加后降低,H202的含量分别在第2h,4h出现高峰,所有处理的H202含量均高于CK,其中处理4的愈伤组织H202含量较高。在第2h时,处理4的峰值为2.68nmol·g-1,较CK提高了54%。在第4h时,处理4的峰值为2.84nmol·g-1,较CK提高了37%。暗培养时间4-20d的愈伤组织中H202的含量总体变化幅度不大,取样时间对H202含量影响不大。2不同时间紫外线照射和不同取样时间对愈伤组织形态和白藜芦醇(Res)含量影响不同时间紫外线照射对虎杖愈伤组织处理后,1-5小时内,愈伤组织无明显变化,颜色仍为嫩绿,形态蓬松。第四天起,随着时间的推移,愈伤组织出现老化,生长缓慢,比CK出现老化提前8天左右。而各处理的Res含量变化趋势是短时间内(1-5h)无规律的起伏变化,到达第4天后,Res含量明显的增高,并在第12天时到达高峰,处理3处理的Res含量较CK差异明显；处理后的第12d,各处理的Res的含量均下降。在整个Res含量变化趋势中,处理3的Res含量一直处于较高水平。3培养基中外加H2O2和H202淬灭剂对愈伤组织形态和Res含量的影响按照H202相对含量最高的愈伤组织中的H202含量比例,分别加入H202和H202淬灭剂于培养基中,继代愈伤组织于培养基上,接种后,1-5小时内,愈伤组织均无明显变化,而在第4天加入H2O2的愈伤组织已出现明显老化,而培养基中加入H2O2淬灭剂的愈伤组织继代后形态变化趋势和CK相似,在第4天未出现明显老化,到达12d后,愈伤组织出现老化。外加H202和H202淬灭剂的愈伤组织取样时间仍按照短时间(1-5h)和长时间(4-20d)来进行取样,取出的愈伤组织经过HPLC测定Res后,结果显示外加H202愈伤组织的Res含量1-5小时和第4天均略高于CK,而在4天后,Res含量明显低于CK,且在12d差异明显。加入H202淬灭剂的愈伤组织,1-5h内和CK的Res含量无太大差异,4-20d时Res含量略有增加,但明显低于CK。4.RS基因表达水平的检测将含白藜芦醇最高的愈伤组织,外加H202愈伤组织和对照组愈伤组织分别提取出RNA并进行电泳检测完整性,结果表明,3个样品的28S,18S,5.8S均显示清晰,表明提取的总RNA质量较好且比较完整,符合后续RT-PCR扩增的实验要求。将提取所得RNA进行半定量RT-PCR扩增,反应结束后,取1.2μ1的产物,以添加Rnase清除剂的TAE为缓冲液,90V/cm电泳20min后,于紫外灯下观察拍照。三个样均在600bp左右扩增出内参照基因actin,且亮度和宽度无差异,表明内参照基因稳定表达,利用特异性引物,Res含量最高组在1000bp上方扩增到期望的1200bp左右的特异性片段A,而对照组和外加H202组未扩增到该片段,说明经过紫外线照射后,RS基因表达水平得到了提高。
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