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Extraction, Identification and Bioactivities of the Flavonols from Fresh Seed Epicarp of Nelumbo Nucifera Gaertn

作　者: 胡赛因·默罕默德·克莱迪
导　师: 谢笔钧
学　校: 华中农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 莲子壳(Nelumbo nucifera Gaertn.) 黄酮和黄酮苷元黄酮含量 HPLC-ESI-MS~2 抗氧化活性抗肿瘤
分类号: S645.1
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

莲子中含有促进健康的营养成分,其提取物(EFSENN)具有抗氧化和清除自由基活性。然而,对新鲜莲子壳(FSENN)中黄酮类物质的抗氧化活性、抗肿瘤活性及其结构鉴定鲜见报道。本研究的主要目的是鉴定莲子壳60%甲醇提取物(EFSENN)中的抗氧化活性组分,并鉴定其中一个组分中的黄酮类物质,了解其结构和抗肿瘤活性。在这里,结合了现代分析技术、生物技术以及分子生物学来研究从EFSENN分离得到的黄酮类物质的结构和生物活性。主要结果如下：1.黄酮提取和FSENN中的组分用60%的甲醇溶液从2000g莲子壳中可以得到25g提取物(EFSENN), EFSENN用Toyopearl HW-40S进行分级,得到三个组分,分别为Frl (130 mg), Fr2 (1.8 g)和Fr3 (200 mg)。采用Folin-Ciocalteu方法来测定组分中总酚的含量,Fr3中的总酚含量(相当于872.87mg没食子酸/g)比Fr2和Fr1高,其分别为768.11和138.75mg没食子酸/g。2.鉴定EFSENN中Fr2的黄酮苷元种类及其含量利用HPLC-UV来确定从EFSENN分离得到Fr2中的苷元组成；通过与已有的标准品比对,可以知道Fr2中含有四种苷元,分别为杨梅黄酮,槲皮素,山奈酚和异鼠李素；通过制作标准曲线来测定这四种苷元在Fr2中的含量,其中槲皮素(10.2mg/g干重)高于异鼠李素(6.2 mg/g干重),其次是山奈酚(2.8 mg/g of干重)和杨梅黄酮(0.4 mg/g干重)。3.LC/UV/MS分析利用LC/UV/MS在线分析Fr2中的黄酮的成分。在负离子模式下得到的有效信息,包括分子量、苷元以及糖基组成,进而分析得到六种糖基化组分。通过以下信息可以推断出峰1为杨梅黄酮-脱氧己糖：其准分子离子峰m/z[M-H]-为479,苷元离子峰m/z[A-H]-为316.9,A环碎裂为碎片离子m/z 150.9和其他碎片离子270.9两部分。通过与芦丁标准品对照可以推出峰2是芦丁(609 m/z)。峰3是槲皮素-脱氧己糖,其准分子离子峰m/z[M-H]-为463,而其二级质谱峰为at m/z 300.9.通过以下信息可以推断出峰4是山奈酚-单六碳糖-单六碳糖：其m/z[M-H]-为593,而二级质谱m/z[A-H]-为285。峰5为异鼠李素-单六碳糖-单六碳糖,其准分子离子峰m/z[M-H]-为623,而二级质谱[A-H]-315的进一步碎片离子为m/z 270.9和m/z254.9。通过分子离子峰m/z[M-H]-为477,以及碎片离子m/z[A-H]-.为315和A环裂解的两个碎片离子m/z 150.8和m/z 270.9,可以推断出峰6为异鼠李素-脱氧己糖；通过分子离子峰m/z[M-H]-301,以及其二级碎片离子m/z 178.9、m/z 150.8和m/z106.9可以推出峰7为槲皮素。4.EFSENN中组分的抗氧化活性通过DPPH自由基清除实验、β-胡萝卜素漂白方法分析、铁离子还原实验和总抗氧化能力的测定等体外抗氧化(T-AOC)实验来评价其抗氧化活性。采用CuSO4-. Phen-Vc-H2O2-DNA化学发光法测定组分在抑制DNA氧化损伤的作用；在体外,通过化学发光方法测定组分清除羟基自由基(CuSO4-Phen-Vc-H2O2 system)和过氧化氢(1uminol-H2O2 system)的能力；比较分析得出,Fr3清除DPPH自由基的能力最大,其在β-胡萝卜素漂白实验中显示出最强的抗氧化能力,然后依次是Fr2和Fr1；从我们的实验结果中可以得知,这几个组分都有显著的使铁离子还原成亚铁离子的能力；组分的总抗氧化能力从32.4到113.4 U/mg,其中以Fr2的最强；其次是Fr3和Fr1；结果显示Fr3在抑制DNA损伤作用的能力比Fr2和Fr1高,其IC50分别为5±0.85,8.3±0.09和46.2±0.13μg/mL; Fr2清除羟基自由基的IC50 (40±0.14μg/mL)是最小,依次是Fr3和Fr1；在清除过氧化氢实验中,Fr2和Fr3的能力相同(0.62μg/mL)。5.体外抗肿瘤活性研究Fr2的体外抗肿瘤活性是通过MTT法来测定组分对HeLa细胞的毒性作用,然后通过流式细胞仪和免疫印迹等来确定其抗肿瘤活性,MTT结果表明样品存在良好的剂量-效果关系,其IC50μg/mL为50μg/mL,在样品浓度为200μg/mL时,能最大抑制细胞生长(>90%)。用浓度为150μg/ml的样品处理细胞,其G2/M分裂期递增15.96±0.59%。与对照组的G1浓度降低相比,用Fr2处理过的细胞其G2/M分裂期呈现递增趋势。这些结果表明Fr2中的黄酮类物质经由G2/M分裂期来抑制细胞增殖存在剂量-效应关系。进一步研究,得出对Bax具有上调节作用,Bcl2具有下调节作用,以及对NF-κB的抑制作用。6.结论EFSENN中的各个组分都有很高的抗氧化活性,Fr2中的黄酮类物质具有抗肿瘤活性,将可以用于治疗和预防多种疾病,并具有作为保健食品的潜力。

全文目录

Abstract  7-11
摘要  11-14
Abbrevations  14-16
Chapter 1 Introduction  16-21
  1.1 General information about the lotus plant  16-17
  1.2 Motivation of this study  17-18
  1.3 Introduction to flavonols and the health benefits of the lotus  18-19
  1.4 Study aims and general design  19
  1.5 Hypothesis and objectives  19-20
  1.6 Organisation of the thesis  20-21
Chapter 2 Literature Review  21-75
  2.1 General information about the lotus  21-22
  2.2 Nutritional value of the lotus  22-23
  2.3 Traditional knowledge of the lotus  23-24
  2.4 Antioxidants of the lotus  24-27
  2.5 Anticancer activity of the lotus  27-28
  2.6 Inedible parts of the lotus  28-29
  2.7 Phenolics  29-41
    2.7.1 Properties and classification of phenolic compounds  29-33
    2.7.2 Bioactivities of dietary polyphenols  33-34
    2.7.3 Flavonoids  34-41
  2.8 Several techniques  41-49
    2.8.1 Extraction  41-43
    2.8.2 Column chromatography  43-44
    2.8.3 Preparative HPLC  44-46
    2.8.4 Liquid chromatography (LC)-MS  46-49
  2.9 Evaluation of antioxidant capacity  49-53
    2.9.1 HAT assays using molecular probes  50-51
    2.9.2 ET assays using molecular probes  51-53
  2.10 In vitro anticancer screening  53-58
    2.10.1 Proliferation assay  54-56
    2.10.2 Cell cycle analysis  56-57
    2.10.3 Western blot analysis  57-58
  2.11 References  58-75
Chapter 3 Materials and Methods  75-87
  3.1 Plant materials  75
  3.2 Chemicals and instruments  75-76
  3.3 Flavonols extraction from FSENN  76
  3.4 Fractionation of EFESEL  76-77
  3.5 Evaluation of antioxidant activities  77-81
    3.5.1 Determination of total phenolic content  77-78
    3.5.2 DPPH radical scavenging activity  78
    3.5.3 Test for ferric ion reducing capacity  78-79
    3.5.4 Determination of T-AOC  79
    3.5.5 Determination of antioxidant activity by the β-carotene bleaching method  79-80
    3.5.6 Chemiluminescence assay  80-81
  3.6 Identification of flavonols and flavonol content  81-83
    3.6.1 Acid hydrolysis of EFSENN Fr2  81-82
    3.6.2 Preparation of flavonols standard solutions  82
    3.6.3 Identification and quantify of flavonol by HPLC  82
    3.6.4 LC/UV/MS analysis  82-83
  3.7 In vitro anticancer screening  83-85
    3.7.1 Cell cultures  83
    3.7.2 MTT assay  83-84
    3.7.3 Flow cytometric analysis  84
    3.7.4 Western blot analysis  84-85
  3.8 Statistical analyses  85
  3.9 References  85-87
Chapter 4 Results and Discussion  87-126
  4.1 Yield of the flavonoid extract from FSENN  87-88
  4.2 Evaluation of antioxidant activities  88-98
    4.2.1 Total phenolic content  88-89
    4.2.2 DPPH radical scavenging activity  89-91
    4.2.3 Test for ferric ion reducing capacity  91-93
    4.2.4 Determination of T-AOC  93-94
    4.2.5 Determination of antioxidant activity by the β-carotene bleaching method  94-95
    4.2.6 Chemiluminescence assay  95-98
  4.3 Identification and quantification of flavonols  98-100
  4.4 LC/UV/MS analysis  100-109
  4.5 In vitro anticancer screening  109-117
    4.5.1 In vitro assay for cytotoxic activity (MTT assay)  109-110
    4.5.2 Effect of flavonols in Fr2 on cell cycle distribution  110-111
    4.5.3 Effect of Fr2 on p21 and p53 expression  111-114
    4.5.4 Effect of flavonols in Fr2 on Bcl-2 and Bax  114-116
    4.5.5 Effect of flavonols in Fr2 on NF-κB  116-117
  4.6 Referances  117-126
Chapter 5 Conclusions and Recommendations  126-128
  5.1 Conclusions  126-127
  5.2 Recommendations  127-128
Appendix  128-130
  Search publication  128-129
  Testimony of editing and proofreading  129-130
Acknowledgements  130

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