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副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其tbpA基因PCR-RFLP分型

作　者: 刘辉
导　师: 杨增岐
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 副猪嗜血杆菌分离鉴定药敏试验 tbpA基因 PCR-RFLP分型
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

副猪嗜血杆菌病,又称猪革拉瑟氏病(Gl?sser’s Disease),是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, Hps)引起的主要导致保育期仔猪发生多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎的一种细菌性疾病。近年来,该病在世界范围内广泛流行,且发病率和死亡率呈现显著的上升趋势,给我国的养猪业也造成了巨大的经济损失。随着该病危害的不断加重,人们对其研究也在逐渐增多,国内部分省市已成功分离获得了当地的副猪嗜血杆菌菌株,并进行了流行病学研究,但对陕西省副猪嗜血杆菌的流行情况及流行菌株的分子特点则报道较少。本研究从陕西省关中地区分离鉴定出了5株副猪嗜血杆菌菌株,建立了较稳定的副猪嗜血杆菌保存方法,对分离株进行了常见药物的敏感性试验,并通过针对副猪嗜血杆菌tbpA基因的PCR-RFLP分型方法对5株临床分离株进行了基因分型,为陕西省副猪嗜血杆菌的分子流行病学研究以及该病的治疗提供了一定实验依据,主要研究结果如下:1.为了检测副猪嗜血杆菌在陕西省部分猪场的感染情况,本试验从陕西省关中地区14个患多发性浆膜炎和关节炎猪场的30个样品中分离到5株细菌,并对其进行了形态观察、菌落培养和生化特性的鉴定;再根据副猪嗜血杆菌的16S rRNA序列设计引物对分离菌株进行PCR扩增,将扩增产物连接T载体后测序并进行序列分析,发现获得的基因片段与GenBank中国内外副猪嗜血杆菌16S rRNA序列的同源性均在99%～100%之间,确定分离菌株为副猪嗜血杆菌。该结果表明,关中地区存在副猪嗜血杆菌病的流行。2.对副猪嗜血杆菌的保存方法进行了探索。通过将菌株接种于不同的培养基待其生长良好后置于不同的条件下保存,并间隔一定时间将保存的菌种复苏,观察其是否依然存活来寻求较适合的副猪嗜血杆菌保存条件。结果发现,将副猪嗜血杆菌菌株通过TSB培养基扩大培养两次后加入终浓度为20%的灭菌甘油置于-70℃保存,是副猪嗜血杆菌较适合的保存方法。3.用药敏纸片法检测了5株副猪嗜血杆菌临床分离株对9种药物的敏感性。结果显示,所有的菌株对氟嗪酸、妥布霉素和卡那霉素均100%敏感,对利福平的敏感率也较高(40%),而对于头孢呋新、羧苄青霉素的耐药率则分别高达100%和80%。这个结果表明,5株副猪嗜血杆菌临床分离株的耐药性均比较强,且不同菌株对同一抗生素的敏感性也不同,从而为关中地区副猪嗜血杆菌病的治疗提供了用药依据。4.利用Redondo等建立的针对副猪嗜血杆菌的PCR-RFLP基因分型方法,通过三种限制性内切酶TaqⅠ、AvaⅠ、AfaⅠ对5株副猪嗜血杆菌临床分离株的转铁结合蛋白A编码基因(tbpA)进行了PCR-RFLP基因分型,得到了4种不同的RFLP基因图谱,分别为EBC、BBJ、EBJ、EBJ、EAD,再将这四种基因型与国内外其它相关研究所得到的基因型进行比较分析,结果显示,副猪嗜血杆菌在陕西省关中地区存在多种基因型菌株,且各基因型具有明显的地域特点,为陕西省副猪嗜血杆菌病的分子流行病学研究提供了理论依据。本试验从陕西省关中地区分离鉴定出了5株副猪嗜血杆菌菌株,并对其进行了药物敏感性检测,同时也对分离菌株进行了基于tbpA基因的PCR-RFLP基因分型,为进一步开展本地区副猪嗜血杆菌病的病原分离鉴定、分子流行病学和预防治疗方面的研究提供了一定依据。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
第一章副猪嗜血杆菌生物学特性及其流行病学研究进展  13-28
  1.1 副猪嗜血杆菌病  13-14
  1.2 副猪嗜血杆菌的生物学特性  14-17
    1.2.1 病原学  14-15
    1.2.2 分离鉴定与培养的研究  15-16
    1.2.3 副猪嗜血杆菌计数方法的研究  16-17
  1.3 分型方法的研究  17-20
    1.3.1 血清学分型的研究  17-18
    1.3.2 分子生物学方法分型的研究  18-20
  1.4 动物感染试验的研究  20-22
  1.5 诊断方法研究进展  22-24
    1.5.1 血清学诊断的研究  22
    1.5.2 临床症状及病理变化学诊断  22-23
    1.5.3 免疫组织化学方法的诊断  23
    1.5.4 分子生物学检测方法的研究  23-24
      1.5.4.1 PCR 方法  23-24
      1.5.4.2 原位杂交方法  24
  1.6 与其它病原微生物混合感染的研究  24-25
  1.7 治疗与防制的研究  25
  1.8 副猪嗜血杆菌耐药性的研究  25-26
  1.9 免疫与疫苗的研究  26
  1.10 小结  26-28
第二章副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其保存试验  28-39
  2.1 材料  28-30
    2.1.1 主要试验仪器  28-29
    2.1.2 主要试剂  29
    2.1.3 主要培养基及其配制  29-30
    2.1.4 主要试剂的配制  30
    2.1.5 病料来源  30
    2.1.6 参考菌种  30
    2.1.7 引物  30
  2.2 方法  30-35
    2.2.1 病原菌的分离  30-31
    2.2.2 革兰氏染色镜检  31
    2.2.3 生化试验  31
    2.2.4 分离菌株PCR 检测  31-32
    2.2.5 PCR 产物的回收及测序  32-35
    2.2.6 副猪嗜血杆菌在不同条件下保存时间的测定  35
  2.3 结果  35-37
    2.3.1 患病猪临床症状和病理变化  35
    2.3.2 菌落形态及染色镜检结果  35-36
    2.3.3 生化试验结果  36
    2.3.4 分离菌株PCR 检测结果  36-37
    2.3.5 菌株测序与同源性比较结果  37
    2.3.6 副猪嗜血杆菌保存条件的筛选结果  37
  2.4 讨论  37-38
  2.5 小结  38-39
第三章副猪嗜血杆菌临床分离株的药敏试验  39-43
  3.1 材料  39-40
    3.1.1 主要实验器材  39
    3.1.2 主要药品与试剂  39-40
    3.1.3 试验菌株  40
    3.1.4 主要培养基及其配制  40
  3.2 方法  40-41
    3.2.1 副猪嗜血杆菌分离株的复壮  40
    3.2.2 分离菌株药敏试验  40
    3.2.3 抗生素敏感性判定标准  40-41
  3.3 结果  41
    3.3.1 分离菌株药敏试验结果  41
  3.4 讨论  41-42
  3.5 小结  42-43
第四章副猪嗜血杆菌临床分离株的PCR-RFLP 分型  43-50
  4.1 材料  43-45
    4.1.1 主要实验器材  43-44
    4.1.2 主要试剂  44
    4.1.3 主要培养基及其配制  44
    4.1.4 细菌菌种  44
    4.1.5 引物  44-45
  4.2 方法  45-46
    4.2.1 分离菌株总DNA 的提取  45
    4.2.2 分离菌株tbpA 基因的RFLP 分型  45-46
  4.3 结果  46-48
    4.3.1 分离菌株tbpA 基因PCR 扩增结果  46-47
    4.3.2 分离菌株限制性片段长度多态性分析结果  47-48
    4.3.3 分离菌株PCR-RFLP 基因型命名结果  48
  4.4 讨论  48-49
  4.5 小结  49-50
结论  50-51
参考文献  51-58
附录  58-61
英文缩略词及中英文对照  61-62
致谢  62-63
作者简介  63

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其tbpA基因PCR-RFLP分型

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