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山里红叶化学成分及抗脂肪肝作用研究

作　者: 英锡相
导　师: 李发美
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药物分析学
关键词: 山里红叶 脂肪肝 抗氧化 药代动力学 HPLC UPLC-MS/MS
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


山里红叶是蔷薇科植物山里红（Crataegus pinnatifidaBge．var．major N．E．Br．）的干燥叶，是《中华人民共和国药典》2005版收载的山楂叶的一种。本文采用山里红叶作为研究对象，采用现代药理及分析方法，研究了山里红叶提取物的抗脂肪肝作用及其活性成分。本研究首先采用复合方式建立高血脂造成大鼠脂肪肝模型对山里红叶提取物预防脂肪肝的药理作用进行研究。并对药理实验结果进行方差分析，结果表明：山里红叶的70％乙醇提取物对降脂药理指标均有非常显著的影响，与模型组相比血清总胆固醇（TC），血清甘油三脂（TG），血清谷丙转氨酶（ALT）及谷草转氨酶（AST），高密度脂蛋白胆固醇（HDL）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL），肝体比及病理学检查等指标有显著变化（P＜0.05），结果说明70％乙醇提取物有明显预防脂肪肝的作用。提取物经AB-8大孔树脂处理后，再经溶剂萃取，所得的氯仿、正丁醇及水三个部位提取物进行抗脂肪肝药理作用研究，最后经药理实验研究证明山里红叶70％乙醇提取物中的正丁醇萃取层为最佳活性部位。本研究首次对山里红叶抗脂肪肝的最佳活性部位提取的工艺进行优化，以70％乙醇为溶剂进行提取，并对70％乙醇用量、提取时间和提取次数三个因素进行了考察，筛选最佳提取工艺。目前中药、天然药物及活性成分的提取分离和纯化常以大孔吸附树脂作为处理手段。因此，本研究以总黄酮类成分及出膏率为指标，对AB-8、D-101、NKA-9三种型号大孔吸附树脂进行了考察，确定以AB-8对提取物进行纯化，先用水除去杂质后，再采用70％乙醇洗脱总黄酮，减压回收乙醇，以氯仿、正丁醇分别萃取，确定最佳纯化工艺。为明确山里红叶提取物抗脂肪肝药效成分，研究中对活性部位的化学成分进行分离。按山里红叶活性部位最佳提取工艺，采用70％乙醇作为提取溶剂，经AB-8大孔吸附树脂处理后，以氯仿、正丁醇分别萃取。正丁醇层提取物以硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、薄层色谱等技术进行分离纯化，运用ESI-MS及NMR等技术进行了化学结构鉴定，并与相关文献对照，由正丁醇层中分离纯化得到了9种化合物，其中牡荆素-4′-0-葡萄糖苷，牡荆素-4′-鼠李糖苷为在该植物中首次发现。中药的各种化学成分是防治疾病的物质基础，以一种指标性成分的含量测定作为质量控制依据，难以全面反映该药品药效。因此，本文首次建立了以HPLC色谱技术，并采用内标法对山里红叶提取物中8种活性成分同时测定，方法先进、准确、可靠。另外标准提取物制定是要以确定药材采收期作为前提的，故本文以山里叶8种活性成分含量的动态变化为依据，再结合山里红叶产率，系统研究了山里红叶的化学成分-采收时间之间相互关系的动态特征，进而确定山里红叶最佳采收期，为山里红叶标准提取物研制提供前提保证。抗氧化与脂肪肝有着密切关系，为了研究抗脂肪肝作用机制，本文首次采用细胞培养技术对山里红叶提取物中活性部位主要黄酮类成分牡荆素-2″-0-鼠李糖苷进行抗氧化研究。首次采用高效液相色谱法，结合TBA衍生化技术，定量测定ECV304细胞培养液中氧化产物MDA，并根据氧化产物MDA含量，定量研究牡荆素-2″-0-鼠李糖苷活性成分抗氧化作用能力。研究结果证明牡荆素-2″-0-鼠李糖苷有较高的保护ECV304细胞损害作用，具有较强的抗氧化能力。对于0.5 mmol·L-1 TBHP诱导氧化细胞反应，牡荆素-2″-0-鼠李糖苷在15.6～125μmol·L-1剂量范围内作用24 h，显著地抑制TBHP诱导ECV304细胞氧化，随着剂量的增加，这种抑制显著增强，结果证明牡荆素-2″-0-鼠李糖苷最适当浓度为62.5μmol·L-1，这说明在此浓度内，该化合物显示剂量依赖抗氧化效应，超过此浓度时，MDA浓度降低缓慢。本文首次建立了HPLC-UV法测定牡荆素-2″-0-鼠李糖苷四个剂量静脉给药的大鼠血浆浓度分析方法，以橙皮苷为内标测定血浆中牡荆素-2″-0-鼠李糖苷。结果表明：大鼠静脉给药牡荆素-2″-0-鼠李糖苷的药物动力学符合二室模型、具有线性动力学特征，这些结果为其开展临床试验提供了重要的理论依据，有利于临床给药方案的设计及阐明药效、副反应等。由于黄酮苷类某些成分的特点，经口服后，化学成分与肠道菌群发生相互作用而影响药物吸收，再则由于分析仪器灵敏度的限制等因素，因此，文献报道口服给药山里红叶活性成分体内药代动力学研究较少。本文首次建立了UPLC-MS／MS法测定口服给药山里红叶提取物及单体牡荆素-2″-0-鼠李糖苷大鼠血浆中牡荆素-2″-0-鼠李糖苷的分析方法，专属性强，灵敏度高，分析速度快，有良好的精密度及准确度，非常适用于牡荆素-2″-0-鼠李糖苷药代动力学研究。样品仅需一步萃取，操作简单，定量下限为10 ng·mL-1，其检测限可达2 ng·mL-1，每个样品分析时间仅需3.0min，为研究山里红叶提取物及活性成分在大鼠体内药物动力学研究提供了可靠的分析手段。实验结果表明：牡荆素-2″-0-鼠李糖苷在大鼠体内360min内基本消除，灌胃给药牡荆素-2″-0-鼠李糖苷与山里红叶提取物相比，其吸收达峰时间基本一致，血浆中检测到牡荆素-2″-0-鼠李糖苷浓度较低，Cmax和AUC较小，其他药动参数与提取物给药基本一致。牡荆素-2″-0-鼠李糖苷在大鼠血浆中药-时曲线符合二室模型的一级吸收。总之，本研究是多学科技术相结合，研究了山里红叶提取物抗脂肪肝作用及其活性成分，研究结果可为山里红叶的应用开发提供实验依据，为中药的现代化研究进行了有意义的探索。本实验仅对牡荆素-2″-0-鼠李糖苷的抗氧化和体内动力学进行了研究，其他成分尚需进一步研究，以全面阐明山里红叶提取物中活性成分与药理作用的密切关系。

全文目录


摘要  11-14
ABSTRACTB  14-17
缩略语  17-18
第一章 前言  18-31
  1.1 山里红叶的研究概况  18-26
    1.1.1 山里红叶的基源  18
    1.1.2 山里红叶的本草考证  18
    1.1.3 山楂叶的药理作用  18-22
    1.1.4 山楂叶的化学成分  22-23
    1.1.5 山楂叶总黄酮及有效成分的提取分析研究现状  23-26
  1.2 脂肪肝的研究概况  26-30
  1.3 本研究立题依据与思路  30-31
第二章 山里红叶抗脂肪肝有效部位的筛选和工艺优化  31-56
  2.1 山里红叶不同提取物抗脂肪肝作用  31-41
    2.1.1 实验材料  31-32
    2.1.2 山里红叶水及不同浓度乙醇提取物的制备  32
    2.1.3 山里红叶各种提取物降脂及抗脂肪肝作用  32-33
    2.1.4 实验结果  33-41
    2.1.5 讨论  41
  2.2 山里红叶提取物抗脂肪肝有效部位筛选  41-49
    2.2.1 山里红叶提取物的制备  41
    2.2.2 动物分组  41
    2.2.3 模型复制和给药  41
    2.2.4 观察指标  41-42
    2.2.5 实验结果  42-48
    2.2.6 讨论  48-49
  2.3 山里红叶有效部位提取工艺研究  49-51
    2.3.1 70%乙醇最佳提取工艺筛选  49-51
    2.3.2 验证试验  51
  2.4 山里红叶预防脂肪肝活性部位纯化工艺研究  51-56
    2.4.1 仪器、药品与试剂  52
    2.4.2 大孔吸附树脂的预处理  52-53
    2.4.3 供试品溶液的制备  53
    2.4.4 大孔吸附树脂型号的选择  53-55
    2.4.5 实验结果  55
    2.4.6 讨论  55-56
第三章 山里红叶提取物化学成分的分离鉴定和含量测定  56-75
  3.1 山里红叶提取物化学成分的提取分离与鉴定  56-62
    3.1.1 仪器、药品与试剂  56
    3.1.2 山里红叶提取物化学成分提取与分离  56-59
    3.1.3 化合物结构鉴定  59-62
  3.2 同时测定山里红叶提取物、山里红叶及山楂叶中8种活性成分  62-75
    3.2.1 仪器、药品与试剂  63
    3.2.2 色谱条件  63-64
    3.2.3 系统适用性试验  64-65
    3.2.4 供试品溶液的制备  65
    3.2.5 标准曲线的绘制  65
    3.2.6 重复性试验  65-66
    3.2.7 回收率试验  66-67
    3.2.8 稳定性试验  67
    3.2.9 山里红叶提取物中8种活性成分同时测定  67-68
    3.2.10 不同产地、不同采收期山里红叶及山楂叶8种活性成分变化研究  68-72
    3.2.11 实验结果  72-73
    3.2.12 讨论  73-75
第四章 牡荆素-2″-O-鼠李糖苷抗氧化活性研究  75-85
  4.1 药品与试剂  75
  4.2 溶液的配制  75-76
  4.3 细胞培养  76
  4.4 细胞生长抑制试验  76
  4.5 牡荆素-2″-O-鼠李糖苷抗氧化作用研究  76-77
    4.5.1 仪器及色谱条件  76
    4.5.2 细胞培养液收集  76
    4.5.3 标准溶液制备  76
    4.5.4 TBA衍生化  76-77
  4.6 结果和讨论  77-83
    4.6.1 HPLC分离  77-78
    4.6.2 TBA衍生化的最佳化  78-80
    4.6.3 线性范围和最低定量限  80
    4.6.4 日内及日间精密度和准确度  80
    4.6.5 回收率试验  80
    4.6.6 稳定性试验  80-81
    4.6.7 TBHP诱导ECV-304细胞凋亡试验  81
    4.6.8 牡荆素-2″-O-鼠李糖苷抑制TBHP诱导细胞凋亡的作用  81-82
    4.6.9 ECV304培养液中MDA的定量测定  82-83
  4.7 小结  83-85
第五章 山里红叶提取物及活性成分的药代动力学研究  85-102
  5.1 静脉给药牡荆素-2″-O-鼠李糖苷的药代动力学研究  85-92
    5.1.1 仪器、药品与试剂  85-86
    5.1.2 色谱条件  86
    5.1.3 标准储备溶液的制备  86
    5.1.4 内标溶液的制备  86
    5.1.5 静脉样品的制备  86
    5.1.6 动物及血浆样品的采集  86
    5.1.7 血浆样品的处理  86
    5.1.8 结果  86-92
    5.1.9 讨论  92
  5.2 灌胃给药山里红叶提取物及牡荆素-2″-O-鼠李糖苷的药代动力学研究  92-102
    5.2.1 仪器、药品与试剂  92-93
    5.2.2 超高效液相色谱条件  93
    5.2.3 质谱条件  93
    5.2.4 标准储备溶液的制备  93
    5.2.5 内标溶液的制备  93
    5.2.6 灌胃样品的制备  93-94
    5.2.7 动物及血浆样品的采集  94
    5.2.8 血浆样品的处理  94
    5.2.9 结果  94-101
    5.2.10 讨论  101-102
第六章 结论  102-105
参考文献  105-113
附图  113-136
致谢  136-137
个人简历  137
在学期间发表论文  137

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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