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马传染性贫血病毒弱毒疫苗株S2基因在体内变异分析

作　者: 王帅
导　师: 曲娟娟
学　校: 东北农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 马传染性贫血病毒 S2基因 变异分析
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


马传染性贫血病毒是（EIAV）逆转录病毒科慢病毒属成员之一,可使马属动物患马传染性贫血,表现为持续感染、反复发热和贫血等症状,该疾病是马属动物主要的传染病之一。二十世纪七十年代,我国科学家成功研制了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗EIAVDLV121。该疫苗具有良好的安全性与诱导免疫保护效果,是世界上第一个成功应用的慢病毒疫苗。而关于弱毒疫苗的致弱机理和免疫机制尚不清楚,围绕该弱毒疫苗我们从分子水平和免疫水平开展了一系列的研究。EIAV其基因组全长约8.2 kb,除含有三个主要结构基因gag、pol和env外,还有三个小开放阅读框架tat（S1）、S2和rev（S3）。S2基因是决定马传染性贫血病毒的毒力以及在体内复制能力的重要基因之一,在弱毒疫苗体外致弱的过程中,S2基因是变异较大的基因之一,由此推测弱毒疫苗的弱化与S2基因在体外传代过程中的变异相关。目前已有对弱毒疫苗gp90基因在体内变异的报道,而关于其S2基因在体内的变异尚无研究。为研究马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株EIAVDLV121的S2基因在马体内变异的规律,本研究选用6匹EIAV抗血清阴性马匹,其中4匹（#1、#2、#5、#8）接种EIAVDLV121,2匹健康对照。接种后在5个月内监测马体温,定期采集血样,检测血小板数量,应用real-time RT PCR方法检测感染马体内的病毒载量,并通过RT-PCR方法获得病毒S2基因在感染马体内不同时期的基因序列,并对所得序列进行生物信息学分析。研究结果显示,EIAVDLV121接种马未出现马传染性贫血体征,外周血病毒载量一直维持在1×106 copies/ml以下,血小板数量和马体温在正常范围内波动;EIAVDLV121接入马匹后,其S2基因在体内不断发生变异,对于#1马, S2基因在体内的氨基酸变异位点主要集中在第17、37、39、41、51和55位,#2马主要集中在第17、22、37、39、41、51和55位,#5马主要集中在第6、18、22、37、39、41、51和55位,#8马主要集中在第37、39、41、51和55位。其中, #1马第3、7、8检测时间点的序列和#8马的第1检测时间点的序列变为亲本致病性强毒EIAVLN40的S2基因型,与致病性强毒亲缘关系最近,核苷酸平均差异率分别为0.4 %、0.5 %、0.3 %和0.5 %,氨基酸平均差异率分别为0.9 %、1.3 %、0.8 %和1.3 %,但未引起病毒毒力的改变。研究结果进一步表明EIAV驴白细胞弱毒疫苗EIAVDLV121具有良好的安全性,其S2基因在马体内并不保守,S2基因在体内的变异对马传染性贫血病毒弱毒疫苗毒力的影响并不显著。以上的首次EIAV弱毒疫苗S2基因在体内变异结果有助于对EIAV及EIAV疫苗株在马体内的感染进程的研究,为研究EIAV疫苗株的致弱机理提供依据。

全文目录


摘要  8-9
英文摘要  9-11
1 引言  11-23
  1.1 马传染性贫血病毒概述  11-19
    1.1.1 EIAV 的形态和基因组  11-17
    1.1.2 EIAV 的生物学特性  17-18
    1.1.3 EIAV 的生命周期  18-19
  1.2 马传染性贫血病毒弱毒疫苗  19-21
    1.2.1 慢病毒疫苗研究的艰巨性  19-21
    1.2.2 马传染性贫血病毒弱毒疫苗的研制  21
  1.3 本实验目的和意义  21-23
2 材料和方法  23-27
  2.1 材料  23-24
    2.1.1 毒株，质粒与实验动物  23
    2.1.2 培养基  23
    2.1.3 主要试剂  23
    2.1.4 主要仪器与设备  23-24
  2.2 方法  24-27
    2.2.1 试验马匹的分组与病毒接种  24
    2.2.2 样品采集  24
    2.2.3 马体温与血小板数量的监测  24
    2.2.4 血浆中病毒RNA 的提取  24
    2.2.5 马体内病毒载量的测定  24-26
    2.2.6 S2 基因在马体内的变异分析  26-27
3 结果与分析  27-37
  3.1 Real-time RT-PCR 标准曲线的建立  27-28
  3.2 试验马匹体温、血小板数量及病毒载量动态分析  28-31
  3.3 S2 基因在马体内变异分析  31-37
    3.3.1 S2 基因的扩增  31-32
    3.3.2 进化树分析  32-33
    3.3.3 氨基酸变异位点分析  33-35
    3.3.4 遗传距离分析  35-37
4 讨论  37-39
5 结论  39-40
致谢  40-41
参考文献  41-48
附录  48-54
攻读学位期间发表的学术论文  54

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 病毒病
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