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水稻杂种花粉不育的细胞学研究及两个杂种花粉不育基因的精细定位

作　者: 汪勇
导　师: 翟虎渠
学　校: 南京农业大学
专　业: 遗传学
关键词: 杂草稻近等基因系杂种花粉不育细胞学精细定位
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

水稻不仅是世界上重要的粮食作物之一,而且是单子叶植物基因组研究的模式植物,全球一半以上的人口以稻米为主食。近年来,由于改良品种的广泛应用和育种家对亲本选择的偏好,使得水稻基因资源变得越来越单一,遗传基础变得越来越狭窄,新的有利基因出现的概率也越来越低,导致水稻产量出现徘徊不前的尴尬局面。为了丰富水稻的遗传基础,进一步提高水稻产量,突破育种的瓶颈效应,从目前水稻育种实践来看,最有效途径就是从水稻远缘物种中引进优良的基因资源,对水稻材料进行改良,从而创造出具有重要意义的水稻新种质。杂草稻和非洲栽培稻稻种资源中广泛存在着各类抗病虫、耐盐碱、抗旱、耐高温等相关性状的优良基因,如能引入亚洲栽培稻中,必将使水稻育种产生新的飞跃。但亚洲栽培稻与杂草稻、非洲栽培稻存在严重的生殖隔离,致使其杂种F1表现高度不育,极大限制了杂草稻和非洲栽培稻的有利基因向亚洲栽培稻的转移及栽培稻种间远缘杂种优势的利用。因此深入探讨亚洲栽培稻与杂草稻以及非洲栽培稻间杂种不育的细胞学机理,挖掘更多的杂种不育基因,并发现相应的广亲和基因,这对于克服亚洲栽培稻与杂草稻、非洲栽培稻间的杂种不育,进而有效利用栽培稻种间的远缘杂种优势,并最终创造出水稻新种质具有重要的理论价值和实践意义。本研究利用云南杂草稻和广亲和品种02428杂交,从细胞学角度深入探讨杂种F1花粉败育的机理,利用02428//云南杂草稻/02428 BC1F1群体在全基因组范围内构建了一张分子连锁图谱,检测到一个控制杂种花粉不育的主效QTL:qPS-1,并对其进行了精细定位；同时从系统发育和进化角度进一步分析云南杂草稻与栽培稻、野生稻间的亲缘关系,探讨云南杂草稻可能的起源。此外,以滇粳优1号为受体亲本,非洲栽培稻IRGC 102295为供体亲本,构建了一个近等基因系NIL,证明滇粳优1号与NIL杂种F1花粉半不育受一对杂合基因座位控制,并把这个基因命名为S37,阐明其杂种F1花粉败育的细胞学机理,并对S37进行精细定位和候选基因的分析,这为进一步图位克隆S37,并最终阐明栽培稻种间杂种花粉不育的分子机理奠定坚实的基础。本论文的主要研究结果如下：1.云南杂草稻与广亲和品种02428杂交,杂种F1的花粉育性表现为典型不育,败育类型包括：典败、圆败和染败,且正反交两组合的花粉育性差异不显著。细胞学研究表明：杂种F1花粉的败育发生在二胞花粉早期,败育的原因是：小孢子第一次有丝分裂出现异常,不能正常形成生殖核；同时,花药横切面的石蜡切片也证明：杂种F1花粉的败育与绒毡层无关,其绒毡层能正常形成和降解。苯胺蓝染色发现：两亲本的柱头都有大量花粉粒附着,并有花粉管伸入到花柱中；而杂种Fl柱头上,很少看到花粉粒的附着,不能观察到花粉管伸入到花柱中。综合辅助授粉的结果表明：杂种F1小穗育性的降低是由较低的花粉育性和花粉在柱头上存在着萌发障碍两因素共同造成,与胚囊无关。2.利用02428//云南杂草稻/02428 BC1F1群体在全基因组范围内构建了一张分子连锁图谱,分别在第1和8染色体上各检测到一个控制杂种花粉不育性的QTL,命名为：qPS-1和qPS-8。qPS-1位于SSR标记RM5和RM493之间,LOD值为11.3,贡献率为22.7%；qPS-8位于SSR标记RM210和LD13之间,LOD值为2.7,贡献率为12.4%。这两个位点间不存在互作效应,彼此独立控制花粉育性,且qPS-1是一个主效而稳定的控制杂种花粉不育的位点。3.利用02428//云南杂草稻/02428和Ketan Nangka/N22//Ketan Nangka两套BC1F1回交群体,选择花粉育性在85%以上的极端高育单株及花粉育性在65%以下的极端低育单株,最终将qPS-1限定在两个Indel标记LI1和LI14-1之间,其物理距离为110kb,含有27个完整的开放阅读框,其中包含一个已经克隆的杂种花粉不育基因Sa。为了验证qPS-1是否与Sa等位,对02428和云南杂草稻两个亲本进行测序,结果表明：qPS-1实际上与已经报道的Sa等位。4.调查云南杂草稻和栽培稻杂种F1的花粉育性发现Dular和IR36在Sa位点携带有中性等位基因San。随后分析9份杂草稻,64份栽培稻和23份野生稻在两个SNPs位点碱基的差异,结果表明：在SaF和SaM两邻近基因中,野生稻都存在有碱基的分化,籼稻中存在少数碱基的分化,而粳稻中没有发现碱基的分化,杂草稻中存在类似野生稻的碱基分化。同时,聚类分析的结果也表明：云南杂草稻被聚在籼稻中,具有籼型遗传背景,并且跟野生稻具有紧密的遗传关系。据此推断：云南杂草稻可能起源于野生稻和被驯化的远古栽培稻品种的自然杂交。5.以滇粳优1号为受体亲本,非洲栽培稻IRGC102295为供体亲本,经过连续6代的回交构建了一个近等基因系NIL,滇粳优1号与NIL杂种F1花粉表现典型的半不育,败育类型为染败,受一对杂合基因S37控制。透射电镜显示：染败花粉粒内部发生凹陷,细胞体积偏小,并且花粉粒内部只有少量的淀粉粒积累。杂种F1花粉的败育发生在成熟花粉期,败育原因是染败花粉粒的生殖核不能进行第二次有丝分裂,因此不能形成三核花粉粒。6.选择花粉育性作为育性指标,首先利用743株滇粳优1号与NIL杂交F2群体进行连锁分析,初步将S37限定在第12染色体短臂末端的两标记NJ5和G4之间,随后利用扩大的18014株F2群体,最终将S37精细定位到标记HP14和G21之间,物理距离为73kb,该区域包含13个预测基因。花药的定量分析结果表明：LOC_Os12g02800是最有可能的候选基因,它编码一个富含半胱氨酸的蛋白前体,进一步的互补实验和功能研究正在进行中。

全文目录

摘要  8-11
ABSTRACT  11-15
第一章文献综述  15-47
  1 杂种优势  15-18
    1.1 籼粳亚种的遗传分化  15-17
    1.2 杂种优势的表现  17-18
  2 籼粳亚种间杂种不育的细胞学研究  18-23
    2.1 雄配子败育  18-19
    2.2 雌配子败育  19-21
    2.3 花药开裂障碍  21
    2.4 花粉在柱头上的萌发障碍  21-22
    2.5 雌雄异熟  22
    2.6 胚乳发育受阻或不正常  22
    2.7 环境条件的影响  22-23
  3 籼粳杂种不育的遗传机理  23-26
    3.1 亚种间杂种的细胞质与细胞核之间不协调导致籼粳杂种不育  23-24
    3.2 种间染色体结构差异导致籼粳杂种不育  24
    3.3 籼粳亚种间杂种不育的基因控制理论  24-26
      3.3.1 重复隐性基因配子致死模式  24-25
      3.3.2 单位点孢子体-配子体互作模式  25-26
  4 水稻籼粳亚种间杂种不育基因的定位及克隆  26-35
    4.1 雌配子不育基因的定位  26-29
    4.2 雌配子不育基因的克隆  29-30
    4.3 雄配子不育基因的定位  30-33
    4.4 雄配子不育基因的克隆  33-35
  5 水稻花粉的发育过程  35-41
    5.1 小孢子母细胞形成期  36
    5.2 小孢子母细胞减数分裂期  36
    5.3 小孢子早期  36
    5.4 小孢子中期  36-37
    5.5 小孢子晚期  37
    5.6 二胞花粉早期  37
    5.7 二胞花粉晚期  37
    5.8 成熟花粉期  37-39
    5.9 水稻花粉败育类型  39-41
  6 杂草稻的研究进展  41-44
    6.1 杂草稻的生物学特性  41-42
    6.2 杂草稻的分类和起源  42-43
    6.3 杂草稻的利用前景  43-44
  7 非洲栽培稻的研究进展  44-45
    7.1 非洲栽培稻的形态特征  44
    7.2 非洲栽培稻的生理特征  44-45
    7.3 非洲栽培稻的起源  45
  8 本研究的目的和意义  45-47
第二章云南杂草稻与亚洲栽培稻杂种花粉不育的细胞学研究、基因的精细定位及云南杂草稻的进化研究  47-71
  1 材料与方法  48-51
    1.1 试验材料及田间种植  48-49
    1.2 碘—碘化钾染色法测定花粉育性  49
    1.3 花粉离体培养测定花粉萌发率  49
    1.4 花粉发育过程及花粉在柱头上萌发与花粉管伸长观察  49-50
    1.5 DNA的提取及PCR分析  50
    1.6 引物设计  50-51
    1.7 数据分析  51
  2 结果与分析  51-65
    2.1 YWR、02428及其杂种F_1花粉育性和小穗育性的鉴定  51-53
    2.2 亲本和杂种F_1花粉的细胞学特征  53-57
    2.3 BC_1F_1群体中花粉育性的表现  57
    2.4 分子连锁图谱的构建  57
    2.5 杂种花粉不育QTL的检测与分析  57-59
    2.6 qPS-1的精细定位  59-60
    2.7 对亲本及广亲和品种的Sa基因进行测序分析  60-62
    2.8 聚类分析  62
    2.9 SaF和SaM中SNPs的检测  62-65
  3 讨讨  65-71
    3.1 杂种F_1花粉败育的时期及原因  65-66
    3.2 qPS-1与杂种花粉不育基因Sa等位  66-67
    3.3 云南杂草稻可能的起源及利用前景展望  67-68
    3.4 杂种不育位点中性等位基因的鉴定及利用  68-71
第三章亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂种花粉不育的细胞学研究、基因的精细定位及候选基因的分析  71-97
  1 材料与方法  73-75
    1.1 近等基因系(NIL)的构建  73
    1.2 试验材料及田间种植  73
    1.3 碘—碘化钾染色法测定花粉育性  73
    1.4 花粉离体培养测定花粉萌发率  73-74
    1.5 花粉发育过程及花粉在柱头上萌发与花粉管伸长观察  74
    1.6 DAPI染色观察花粉粒的细胞核  74
    1.7 扫描和透射电镜观察  74
    1.8 分子连锁图谱的构建  74
    1.9 SSR和InDel的标记开发  74-75
    1.10 候选基因的预测与分析  75
  2 结果与分析  75-91
    2.1 滇粳优1号、NIL及其杂种F_1花粉育性和离体萌发调查  75-77
    2.2 滇粳优1号、NIL及其杂种F_1的细胞学观察  77-83
    2.3 F_2群体的花粉育性分布  83
    2.4 S37与分子标记间的连锁分析  83-84
    2.5 标记在F_2中的偏态分离  84-85
    2.6 S37的精细定位  85-87
    2.7 基因预测与分析  87-89
    2.8 预测基因的表达分析  89-91
  3 讨论  91-97
    3.1 杂种不育与偏分离的关系  91-92
    3.2 杂种花粉不育位点S25、S36与S37的位置比较  92-93
    3.3 非洲栽培稻与亚洲栽培稻种间杂种不育障碍的克服及非洲栽培稻有利基因的利用  93-97
第四章全文小结  97-101
  1 全文结论  97-100
    1.1 YWR/02428杂种F_1花粉的败育发生在二胞花粉早期  97-98
    1.2 较低的花粉育性和花粉在柱头的萌发障碍共同导致YWR/02428杂种F_1小穗育性的降低  98
    1.3 qPS-1被精细定位到110kb的范围内且与Sa等位  98
    1.4 云南杂草稻可能起源于野生稻与栽培稻的杂交  98-99
    1.5 NIL/滇粳优1号杂种F_1花粉的败育发生在成熟花粉期  99
    1.6 S37附近的分子标记发生严重的偏态分离  99
    1.7 S37被精细定位到73kb的范围内  99-100
    1.8 LOC_Os12g02800最有可能是S37的候选基因  100
  2 本研究创新之处  100-101
参考文献  101-117
附录  117-125
在读期间发表的论文  125-127
致谢  127

水稻杂种花粉不育的细胞学研究及两个杂种花粉不育基因的精细定位

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