学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

构建组织工程软骨中机械刺激的作用研究

作　者: 李真
导　师: 姚善泾；Mauro Alini
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 软骨组织工程机械刺激软骨细胞骨髓间充质干细胞定向分化 TGF-β信号转导通路纤维蛋白凝胶——聚氨酯支架复合物
分类号: R329
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
下　载: 19次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

机械刺激是软骨组织工程中非常重要的调控因子。本文以软骨细胞和骨髓间充质干细胞为种子细胞,研究了机械刺激在关节软骨组织工程中的作用。首先研究了机械刺激对牛膝关节不同软骨细胞亚群在PRG4、HAS1、HAS2mRNA表达和PRG4、透明质酸蛋白质合成方面的影响。发现机械刺激可以诱导软骨细胞亚群发生显型的改变以适应其环境。软骨细胞各个亚群之间的相互作用对透明质酸的合成有促进作用。使用混合亚群的软骨细胞,在最佳的机械刺激条件和生物化学条件下,可以诱导复合物表层的细胞重新分化具有浅表区细胞显型,从而构建出较完整的关节软骨层次结构和功能性的软骨滑液界面。这对于通常以来自整个关节的各软骨细胞亚群混合细胞作为种子细胞的组织工程有重要的意义。由于软骨细胞作为种子细胞存在来源不足,获取手段复杂且对患者损伤较大的缺点,继而研究了以hBMSCs为种子细胞,体外构建软骨组织过程中机械刺激的作用。为了建立体外hBMSCs成软骨细胞培养体系,研究了纤维蛋白凝胶——聚氨酯支架体系是否支持体外hBMSCs向软骨细胞的诱导分化。通过测量细胞的GAG/DNA值,以Real-time PCR测量细胞的mRNA水平,和组织学及免疫生物化学染色方法,对支架培养和微团培养进行了比较。实验结果表明与微团培养体系相比,在最佳接种密度(5x106个细胞／支架)下,细胞支架复合物具有相似的软骨细胞标志性蛋白合成量GAG/DNA,较高的软骨细胞标志性基因COL2、AGG mRNA水平,和较低的成骨细胞标志性基因Sp7、ALP、BSP2 mRNA水平,同时还具有能够为新生组织的积聚提供空间的优点,有利于进一步使用生物力学的手段优化体外干细胞向软骨细胞的诱导分化。在不同的外源TGF-βl浓度下,研究了机械刺激对hBMSCs分化过程的影响,并使用TGF-βⅠ型受体抑制剂LY364947阻断TGF-β信号转导通路,研究了TGF-β信号转导通路在该过程中的作用。实验结果表明机械剌激可以诱导纤维蛋白凝胶——聚氨酯支架培养的hBMSCs向软骨细胞分化,前提条件是外源TGF-β浓度较低且培养液中含有地塞米松。由于TGF-β本身可诱导hBMSCs成软骨细胞,过高的外源TGF-β浓度下机械刺激的作用会被覆盖。机械刺激通过TGF-β信号转导通路诱导hBMSCs向软骨细胞分化,TGF-β受体抑制剂可以阻断TGF-β信号转导通路从而抑制机械刺激诱导干细胞向软骨细胞分化的作用。对hBMSCs生物支架复合物施加不同强度和频率的循环动压力和表面剪切摩擦力,以观察不同力学环境下hBMSCs的反应。发现机械刺激的频率和幅度可以调控hBMSCs向软骨细胞分化的过程。在本文所采用的机械刺激范围内,较高的机械刺激频率和较高的动压力幅度更有利于hBMSCs向软骨细胞分化,更有利于抑制软骨细胞肥大化。由此说明在以BMSCs为种子细胞的软骨组织工程研究中,对细胞支架复合物施加适当强度的机械刺激非常重要。将视黄酸β受体抑制剂LE135与机械刺激相结合,研究其对hBMSCs分化过程的影响。发现在微团培养和支架培养体系中,视黄酸β受体抑制剂LE135对外源TGF-β和机械刺激诱导的hBMSCs向软骨细胞分化的过程有抑制作用。同样的条件下,LE135对hBMSCs向成骨细胞分化的过程没有影响。

全文目录

致谢  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略语表  10-11
目次  11-15
第一章引言  15-26
  1.1 关节软骨的结构和功能  15-18
  1.2 临床重要性  18-19
  1.3 临床治疗方法  19-20
  1.4 关节软骨组织工程  20-24
    1.4.1 种子细胞  20-21
    1.4.2 支架材料  21-22
    1.4.3 生长因子  22-23
    1.4.4 机械刺激  23-24
  1.5 本文的研究思路和目标  24-26
第二章材料和方法  26-39
  2.1 实验材料  26-29
    2.1.1 细胞来源  26
    2.1.2 试剂  26-27
    2.1.3 仪器及材料  27-28
    2.1.4 溶液的配制  28-29
  2.2 实验方法  29-39
    2.2.1 细胞的分离和传代培养  29-30
    2.2.2 细胞冷冻与解冻  30-31
    2.2.3 hBMSCs微团培养  31
    2.2.4 聚氨酯支架  31-32
    2.2.5 细胞的接种  32
    2.2.6 生物反应器和机械刺激  32-34
    2.2.7 检测方法  34-39
第三章机械刺激对牛关节软骨细胞亚群的影响  39-51
  3.1 前言  39-40
  3.2 实验设计  40
  3.3 结果  40-46
    3.3.1 P0代软骨细胞亚群基因的mRNA水平  40-41
    3.3.2 三维支架培养对软骨细胞亚群基因mRNA水平的影响  41-43
    3.3.3 机械刺激对软骨细胞亚群基因mRNA水平的影响  43
    3.3.4 机械刺激对培养液中PRG4与透明质酸含量的影响  43-46
  3.4 讨论  46-49
  3.5 本章小结  49-51
第四章 hBMSCs复合纤维蛋白凝胶——聚氨酯支架向软骨细胞诱导分化  51-73
  4.1 前言  51-52
  4.2 实验设计  52-53
  4.3 结果  53-67
    4.3.1 DNA含量及GAG合成量  53-55
    4.3.2 mRNA水平  55-58
    4.3.3 组织学与免疫生物化学染色  58-67
  4.4 讨论  67-72
  4.5 本章小结  72-73
第五章机械刺激通过TGF-β信号转导通路调控hBMSCs向软骨细胞的分化  73-87
  5.1 前言  73-74
  5.2 实验设计  74-75
    5.2.1 TGF-β1浓度与机械刺激的量效关系实验  74
    5.2.2 TGF-β1型受体抑制剂实验  74-75
  5.3 结果  75-82
    5.3.1 TGF-β1 浓度与机械刺激的量效关系实验  75-79
    5.3.2 TGF-β1 型受体抑制剂实验  79-82
  5.4 讨论  82-86
  5.5 本章小结  86-87
第六章机械刺激的频率和幅度对hBMSCs向软骨细胞分化过程的影响  87-100
  6.1 前言  87-88
  6.2 实验设计  88-89
  6.3 结果  89-96
    6.3.1 细胞支架复合物所受的机械刺激压力  89-90
    6.3.2 DNA含量及GAG合成量  90
    6.3.3 mRNA水平  90-96
  6.4 讨论  96-99
  6.5 本章小结  99-100
第七章 hBMSCs向软骨细胞分化过程中视黄酸受体抑制剂LE135的作用  100-112
  7.1 前言  100-101
  7.2 实验设计  101-102
    7.2.1 微团培养实验  101-102
    7.2.2 支架培养实验  102
  7.3 结果  102-108
    7.3.1 微团培养实验  102-105
    7.3.2 支架培养实验  105-108
  7.4 讨论  108-111
  7.5 本章小结  111-112
第八章结论与建议  112-115
  8.1 结论  112-113
  8.2 建议  113-115
参考文献  115-132
附录:依据C_1值计算mRNA的相对定量水平  132-133
作者简历  133-134
攻读博士学位期间发表的论文  134-135

构建组织工程软骨中机械刺激的作用研究

内容摘要

全文目录

相似论文