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小檗碱治疗实验性糖尿病心肌病作用和机制研究

作　者: 董世芬
导　师: 孙建宁
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中药药理学
关键词: 小檗碱 实验性糖尿病心肌病 大鼠模型 脂肪积聚 葡萄糖转运 3T3-L1细胞 脂肪因子
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


第一部分实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型建立与评价目的：建立和评价实验性2型糖尿病心肌病(DC)大鼠模型,探究高糖脂饮食在模型诱导过程中的作用。方法：将雄性Wistar大鼠随机分成正常对照组(Control),高糖脂饮食组(HSF)和高糖脂饮食负荷小剂量链脲佐菌素组(HSF-STZ).Control大鼠喂养常规饲料12周,HSF大鼠喂饲高糖高脂饲料12周,HSF-STZ大鼠喂饲高糖高脂饲料6周后一次性腹腔注射30 mg/kg STZ并继续给予高糖高脂饲料6周以诱导2型糖尿病心肌病病变。监测大鼠一般状态；容积阻抗法测定心排量；左心室插管测定血流动力学指标；称重法测定大鼠心脏重量,计算心重指数(HW/BW)和左心室肥厚指数(LVW/BW):心脏赤道面横切作常规HE染色,观察病理变化并计算左心室前壁(LVWT)和室间隔厚度(IST)；生化法测定血液糖、脂代谢指标和心肌组织胶原含量。结果：①HSF-STZ大鼠腹腔注射STZ并继续喂养6周后,与正常大鼠比较,进食量和饮水量分别显著增加16%和84%。②与Control大鼠比较,HSF大鼠喂养高糖高脂饲料4周后,总胆固醇(TCH,26%)和甘油三脂(TG,34%)水平显著升高；HSF-STZ大鼠腹腔注射STZ并继续喂养6周后血浆TCH(44%)、血浆游离脂肪酸(NEFA,100%)和心肌组织NEFA(69%)水平显著升高,高密度脂蛋白值(HDL)降低26%；同时血浆空腹血糖(FBG,233%)、糖化血红蛋白(HbAlc,35%)和糖化血清蛋白(GSP,28%)明显增加。③与Control大鼠比较,HSF-STZ大鼠左心室收缩压(LVSP,15%)、每搏输出量(SV,26%)和心排量(CO,23%)显著降低,左心室舒张末期压力(LVEDP,44%)和左心室最大舒张速率(一dp/dtmax,29%)明显升高。④与Control大鼠比较,HSF-STZ大鼠HW/BW和LVW/BW指数分别升高15%和10%。⑤HE染色结果显示HSF-STZ大鼠心肌纤维排列紊乱、断裂,心肌细胞肥大,细胞核边缘不清、融合,甚至消失；LVWT(33%).IST值(80%)和胶原含量(18%)显著增加。结论：①Wistar大鼠高糖高脂饲料喂养负荷链脲佐菌素(30 mg/kg)腹腔注射可建立实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型。②高糖高脂饲料喂养可诱导肥胖和高血脂,在2型糖尿病心肌病大鼠模型发病过程中有重要作用。第二部分小檗碱治疗2型糖尿病心肌病作用及机制整体实验研究目的：建立实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型,观察小檗碱对模型大鼠机体一般状况,血糖、血脂和心脏功能和结构,心肌组织NEFA、脂肪酸转运和氧化酶含量,以及心肌组织过氧化物增殖体激活受体(PPAR)α、PPARγ和葡萄糖转运体4 (GLUT4) mRNA基因和蛋白表达的影响。方法：糖尿病心朋病大鼠模型(DC rat model)建立同第一部分,小檗碱(Berberine)分为7.5、15和30 mg/kg组,阳性药包括二甲双胍(Metformin) 140 mg/kg组、罗格列酮(Rosiglitazone) 2 mg/kg组和卡托普利(Captopril) 45 mg/kg组,另设正常对照组(Control)。治疗组动物从注射STZ后72小时按相应剂量开始灌胃给药6周。定期监测各组大鼠一般体征变化；生化法检测血糖和血脂,以及心朋组织胶原(Collagen)、肌酸激酶(CK)和NEFA含量；容积阻抗法测定心排量,左心室插管测定血流动力学指标；称重法测定大鼠心脏重量,计算HW/BW和LVW/BW;心脏作常规HE染色,计算LVWT和IST; Elisa去检测心肌红织脂肪酸转运蛋白-1(FATP-1)、脂肪酸转运蛋白(FATPs)和脂肪酸β氧化酶(FA-β-oxidase)含量。实时定量PCR检测心肌组织PPARα、PPARγ和GLUT mRNA基因表达；Western blot去检测PPAR a、PPAR 7和GLUT4蛋白表达。结果：①Berberine 30 mg/kg和Metformin 140 mg/kg可显著抑制DC rat mode体重降低；Metformin 140 mg/kg降低模型大鼠饮水量10%,其余药物均未明显改变动物模型的饮食量。②与DC rat model比较,小檗碱30 mg/kg和Metformi 140 mg/kg可显著降低FBG(69%和67%)、GSP(40%和34%)、HbAlc(46%和42%)和果糖胺(FMN)(40%和34%)含量；Rosiglitazone 2 mg/kg可显著降低降低FBG(36%)和HbAl。(24%)；Captopril 45 mg/kg可明显降低HbAl(31%)。③与DC rat model比较,Berberine 30 mg/kg组动物TCH(42%)、TG(42%)和低密度脂蛋白(LDL)值(40%)显著降低；Rosiglitazone 2 mg/k可显著降低TG(49%)和LDL(37%)水平；Metformin显著降低TG值达41%④与DC rat model比较,小檗碱30 mg/kg组动物LVSP (14%)和左心室最夕收缩速率(+dp/dtmax,81%)明显增加,LVEDP (80%)和-dp/dtmax (55%)显著降低,心排量增加60%; Captopril 45 mg/kg组LVSP(15%)和+dp/dtmax(77%显著增加,-dp/dtmax降低52%,心排量增加54%；Metformin 140 mg/kg组动物+dp/dtmax上升60%,心排量增加71%。⑤与DC大鼠模型比较,小檗碱30 mg/k治疗可明显降低HW/BW (6%)和LVW/BW (9%)指数、心肌组织胶原含量(32%)、IST(20%)和LVWT (46%)值；Metformin 140 mg/kg显著降低术型大鼠心肌胶原含量(26%)和IST水平(26%)。⑥光镜下观察左心室纵切片HE染色结果显示,Berberine 30 mg/kg.Metformin 140 mg/kg和Captopril 45 mg/kg治疗后,心肌组织病理损伤有明显的改善,心肌细胞排列较规则,细胞核清晰可见。⑦与正常大鼠比较,DC rat model心肌组织NEFA和CK含量分别显著升高69%和95%；与DC rat model比较,小檗碱7.5、15和30 mg/kg组动物心肌NEFA含量分别降低34%、27%和25%,阳性药Metformin 140 mg/kg(36%)和Captopril 45 mg/kg(24%)组动物心肌组织NEFA含量也显著下降；Berberine 30 mg/kg.Metformin.Rosiglitazone和Captopril组动物心肌组织CK水平分别降低20%、39%、26%和18%；另外,DC rat model心肌组织FATP一1 (68%).FATPs(22%)和FA-p-Oxidase(47%)含量较正常大鼠比较显著降低,小檗碱30 mg/kg治疗后,大鼠心肌组织FATP-1、FATPs和FA-β-oxidase含量分别提高了159%、56%和91%。⑧与正常大鼠比较,DC rat model心肌组织PPARαmRNA表达升高了80%,Berberine 30mg/kg(54%).Metformin 140mg/kg(40%).Rosiglitazone 2 mg/kg(47%)及Captopril 45 mg/kg(38%)可显著下调心肌组织的PPARαmRNA表达。⑨与正常大鼠比较,DC rat model心肌组织PPARγmRNA基因(38%)和蛋白(40%)表达明显降低；Berberine 30 mg/kg组动物PPARγ基因(50%)和蛋白(83%)表达与大鼠模型比较显著升高；同时,DC rat model心肌组织GLUT4 mRNA基因(34%)和蛋白(68%)表达明显比正常大鼠降低；与DC rat model比较,Berberine 30 mg/kg(32%)和Captopril 45 mg/kg(36%)组动物GLUT4 mRNA基因表达明显升高,另外Berberine 30 mg/kg(133%).Metformin 140 mg/kg(208%)和Rosiglitazone 2 mg/kg(166%)组动物GLUT4蛋白表达也显著升高。结论：小檗碱可显著改善高糖高脂负荷小剂量STZ诱导的实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型心脏舒张功能和收缩功能损伤,并且抑制心肌胶原积聚和左心室重构；同时还可以显著降低大鼠模型血糖、血脂各项指标,并且对糖尿病大鼠一般体征状态有明显改善作用；其作用机制可能与提高心肌组织转录调控因子PPARγ和GLUT4 mRNA基因和蛋白表达,降低PPARαmRNA基因表达,上调下游目的因子FATP-1、FATPs和FA-β-oxidase含量,改善心肌组织脂肪酸的转运氧化能力,提高葡萄糖的转运能力,抑制心肌组织脂质积聚有关。第三部分小檗碱对3T3-L1前脂肪细胞分化、脂肪积聚和脂肪因子分泌的影响目的：培养小鼠3T3-L1前脂肪细胞,观察小檗碱对前脂肪细胞向脂肪细胞分化、细胞甘油三脂积聚以及脂肪因子基因表达的影响。方法：培养小鼠3T3-L1细胞,用含10%胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、5μg/mL胰岛素、1μM地塞米松和500μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的高糖DMEM培养基诱导分化(Day 0),为期3天(Day 0-Day 2).细胞于Day 3,Day 5和Day 7用小檗碱(5μM、10μM和20μM)处理,共给药3次,Day 8进入实验。未分化的细胞称为前脂肪细胞(Preadipocyte)。油红-O染色测定细胞内脂滴积聚,观察细胞内脂滴大小。生化法测定细胞内蛋白和甘油三脂含量。逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测调控前脂肪细胞分化基因和脂质代谢相关基因CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)α、C/EBPβ、PPARγ、脂肪细胞脂质结合蛋白(aP2)和脂肪酸合成酶(FAS),以及脂肪因子脂联素(adiponectin)、瘦素(leptin)、抵抗素(resistin)、血管紧张素原(AGT)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)和单核巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因表达。结果：①小檗碱(5、10和20μM)呈剂量依赖性分别降低脂肪细胞TG值26%、37%和43%,抑制脂质积聚。②小檗碱10μM和20μM可降低脂肪细胞C/EBP a(21%和47%)和PPAR y mRNA(21%和55%)基因表达；小檗碱20μM显著降低C/EBPβmRNA基因表达16%。③小檗碱10μM和20μM分别降低aP2基因18%和40%；20μM显著降低FAS基因表达18%。④前脂肪细胞中未见adiponectin. leptin和resistin基因表达,而脂肪细胞中adiponectin、leptin和resistin mRNA表达明显升高(P<0.001),小檗碱5μM、10μM和20μM呈剂量依赖性分别降低adiponectin(9%、46%和85%)、leptin(33%、75%和100%)和resistin(13%、63%和82%)在脂肪细胞中的表达。⑤3T3-L1前脂肪细胞分化为脂肪细胞后,细胞内AGT mRNA基因表达明显升高84%,小檗碱10μM和20μM分别降低脂肪细胞中AGT mRNA表达15%和24%。⑥3T3-L1前脂肪细胞与脂肪细胞均可以分泌PAI-1和MCP-1,且二者比较,PAI-1和MCP-1 mRNA基因表达并没有明显的差异；小檗碱20μM明显降低脂肪细胞内PAI-1(12%)和MCP-1 mRNA (28%)基因表达。结论：小檗碱可抑制3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化,降低细胞内TG含量和脂滴积聚,这与其抑制细胞分化过程中转录因子C/EBPβ、C/EBP a和PPAR y以及下游与脂肪代谢调节相关的基因aP2和FAS基因表达有关。小檗碱可下调脂肪因子adiponectin、leptin、resistin、AGT、PAI-1和MCP-1基因表达,进一步证实小檗碱对肥胖、糖尿病和心血管疾病的保护作用。

全文目录


目录  4-6
中文摘要  6-11
ABSTRACT  11-22
英文缩略词表  22-28
综述一 糖尿病心肌病与过氧化物增殖体激活受体  28-41
  1. 糖尿病心肌病心脏病变与能量代谢紊乱  28-29
  2. 过氧化物增殖体激活受体的分子特点及调节机制  29
  3. 过氧化物增殖体激活受体与糖尿病心肌病变  29-33
  4. 结语  33-34
  参考文献  34-41
综述二 小檗碱主要的药理作用及机制  41-82
  1. 概述  41
  2. 小檗碱主要的药理作用  41-58
  3. 小檗碱调控糖、脂代谢作用的主要机制总结  58-61
  参考文献  61-82
前言  82-84
第一部分 实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型建立与评价  84-102
  材料和方法  84-88
  结果  88-94
  讨论  94-98
  参考文献  98-101
  第一部分 研究小结  101-102
第二部分 小檗碱治疗2型糖尿病心肌病作用及机制整体实验研究  102-158
  实验一 小檗碱对实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型心脏保护和外周循环物质代谢作用研究  104-127
    材料和方法  104-107
    结果  107-115
    讨论  115-120
    参考文献  120-127
  实验二 小檗碱对实验性2型糖尿病心肌病大鼠心肌糖、脂代谢相关指标的影响  127-136
    材料和方法  127-129
    结果  129-131
    讨论  131-132
    参考文献  132-136
  实验三 小檗碱对实验性2型糖尿病心肌病大鼠心脏PPAR α、PPARγ和GLUT4基因和蛋白表达的影响  136-157
    材料和方法  136-146
    结果  146-151
    讨论  151-153
    参考文献  153-157
  第二部分 研究小结  157-158
第三部分 小檗碱对3T3-L1脂肪细胞分化和脂肪因子分泌的影响  158-186
  材料和方法  159-171
  结果  171-177
  讨论  177-180
  参考文献  180-185
  第三部分 研究小结  185-186
研究总结  186-189
论文创新点  189-190
个人简历  190-192
致谢  192-194
附图  194-198

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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