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β-葡萄糖苷酶-丝素纳米颗粒结合物的生物合成、特性及应用

作　者: 周珍祯
导　师: 张雨青
学　校: 苏州大学
专　业: 生物物理学
关键词: 丝素纳米颗粒 β-葡萄糖苷酶柚苷酶生物结合柚皮苷交联包埋共固定
分类号: TB383.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

蚕丝丝素是一种生物相容性的生物高分子蛋白纤维,经过中性盐溶解、透析和脱盐后获得再生液态丝素。当将这种再生液态丝素迅速引入到能与水混溶的极性有机溶剂丙酮中,丝素蛋白因快速失水、变性而引起其结构β化,由此生成乳白色的丝素微粒。将有机溶剂去除后就可以获得粒径分布在40-120 nm范围内的丝素纳米颗粒。这种结晶性的丝素纳米颗粒不溶于水,但经过超声处理能良好分散在水溶液中。本文以这种丝素纳米颗粒为载体,分别以交联和包埋二种方式,制备了二种β-葡萄糖苷酶-丝素纳米颗粒生物结合物（即结合酶）。以游离酶为对照,利用对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（p-NPG）为底物,分析了这二种酶生物结合物的活性,并对其酶动力学等特性作了较为系统的体外评价。同时探讨了这二种结合酶制备的最佳实验条件。实验结果表明,以戊二醛为交联剂制备的β-葡萄糖苷酶-丝素纳米颗粒在戊二醛浓度为0.25%、交联时间5 h、交联温度37 oC以及酶（U）与丝素纳米颗粒（mg）比例为75:100条件下可获得最佳生物连接的效果;用包埋法制备的β-葡萄糖苷酶-丝素纳米颗粒在酶（U）与丝素蛋白（mg）比例为1:1条件下可获得最佳固定化效果;两种方法所得到的生物结合酶活性回收率分别为46.0%和59.2%。酶动力学性能分析结果表明:二种结合酶和游离的β-葡萄糖苷酶特性相似,最适pH值为5.0,最适反应温度为60oC;游离的β-葡萄糖苷酶表观米氏常数Km=7.26×10^-3 mol·L^–1,而以戊二醛为交联剂的结合酶表观米氏常数Km（app）= 1.41×10^-3 mol·L^–1,包埋法制备的结合酶的表观米氏常数Km（app）’=1.01×10^-2 mol·L^–1,交联酶的表观米氏常数较游离酶的米氏常数降低5倍,这充分表明游离酶通过戊二醛与丝素纳米颗粒表面的活性基团如ε-氨基等生物结合后,其酶与底物的亲和性有较大提高;而包埋法制备的结合酶表观米氏常数较游离酶的米氏常数有所增大,这可能是由于酶被丝素纳米颗粒包埋后,与底物的亲和性略有下降的缘故。游离酶与丝素纳米颗粒结合后,无论是包埋还是交联的方式,它们的热稳定性都有所提高;同时也都具有良好的操作稳定性,可以反复使用。上述结果充分表明丝素蛋白是一种酶修饰或生物结合的良好载体。柚苷酶由α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶组成的复合酶,以戊二醛为交联剂,将这二种酶共固定在丝素纳米颗粒表面,制备成柚苷酶-丝素纳米颗粒结合物。以柚皮苷为底物,采用高效液相色谱法（HPLC）测定这种柚苷酶-丝素纳米颗粒生物结合物的酶活性。实验结果表明,柚苷酶与丝素纳米颗粒共同连接后仍然能够很好的水解柚皮苷,表明其酶活性没受影响。酶动力学性能分析结果表明,结合酶和游离柚苷酶的特性相似,最适反应温度为55 oC;这种柚苷酶-丝素纳米颗粒结合物与底物柚皮苷发生酶促反应后,可以通过高速离心沉淀方法将结合酶与产物（柚皮素和鼠李糖和葡萄糖）分开,沉淀的丝素纳米颗粒结合酶再经过超声悬浮后,可以继续进行酶促反应,当这种连续的反复酶促反应进行8次后,仍能保持70%左右原有酶活性。因此,丝素蛋白不仅是一种酶而且是二种酶修饰或生物结合的良好载体,在柑橘类果汁、葡萄等水果脱苦加工中具有潜在的研究和开发价值。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-11
前言  11-13
第一章文献综述  13-23
  1 β-葡萄糖苷酶简介  13-16
    1.1 β-葡萄糖苷酶  13
    1.2 β-葡萄糖苷酶的活力测定方法  13-14
    1.3 β-葡萄糖苷酶酶学性质的研究  14-15
      1.3.1 β-葡萄糖苷酶的分子大小及组成  14
      1.3.2 β-葡萄糖苷酶的等电点pI 和最适pH 值  14
      1.3.3 β-葡萄糖苷酶的最适反应温度和热稳定性  14
      1.3.4 β-葡萄糖苷酶的动力学研究  14-15
    1.4 β-葡萄糖苷酶作为风味酶的应用  15-16
  2 β-葡萄糖苷酶固定化研究进展  16-21
    2.1 吸附法  16-17
    2.2 包埋法  17-18
    2.3 共价法  18-19
    2.4 交联法  19-21
  3 柚苷酶在果汁脱苦作用中的研究进展  21-23
    3.1 柚苷酶的性质及作用机理  21
    3.2 柚苷酶在柑橘果汁加工中的应用  21-22
    3.3 柚苷酶固定化研究进展  22
    3.4 果汁脱苦工艺面临的问题  22-23
第二章实验材料与方法  23-30
  1 实验材料、试剂和仪器  23-24
    1.1 实验材料  23
    1.2 主要仪器  23-24
    1.3 主要试剂  24
  2 实验设计与方法  24-30
    2.1 液态丝素的制备  24
    2.2 丝素纳米颗粒的制备  24-25
    2.3 β-葡萄糖苷酶-丝素纳米颗粒生物结合物的制备  25
      2.3.1 交联型β-葡萄糖苷酶-丝素纳米颗粒生物结合物的制备  25
      2.3.2 包埋型β-葡萄糖苷酶-丝素纳米颗粒生物结合物的制备  25
    2.4 β-葡萄糖苷酶酶活力的测定  25-26
      2.4.1 测定原理  25-26
      2.4.2 测定方法  26
    2.5 修饰反应条件的优化  26-27
      2.5.1 以戊二醛为交联剂的β-葡萄糖苷酶-丝素纳米颗粒结合物制备条件的优化  26-27
        2.5.1.1 交联剂戊二醛浓度的确定  26
        2.5.1.2 丝素纳米颗粒修饰剂与酶量比例的确定  26-27
        2.5.1.3 交联时间的确定  27
        2.5.1.4 交联温度的确定  27
      2.5.2 包埋法制备β-葡萄糖苷酶-丝素纳米颗粒生物结合物条件的优化  27
        2.5.2.1 丝素蛋白量与酶量比例对修饰影响试验  27
    2.6 酶生物结合物的动力学分析  27-28
      2.6.1 酶生物结合物的米氏常数  27-28
      2.6.2 反应温度对酶生物结合物活力影响的试验  28
      2.6.3 酸碱度（pH 值）对酶生物结合物活力影响的试验  28
      2.6.4 酶生物结合物的热稳定性试验  28
      2.6.5 操作稳定性的测定  28
    2.7 丝素纳米颗粒结合酶在食品加工中的应用  28-30
      2.7.1 交联型柚苷酶-丝素纳米颗粒生物结合物的制备  28-29
      2.7.2 酶解反应  29
      2.7.3 柚皮苷的检测  29
      2.7.4 反应温度对酶生物结合物活力的影响试验  29
      2.7.5 操作稳定性的测定  29-30
第三章实验结果与分析  30-48
  1 酶修饰条件的优化  30-35
    1.1 戊二醛浓度对β-葡萄糖苷酶生物连接的影响  30-31
    1.2 交联反应时间对β-葡萄糖苷酶修饰的影响  31-32
    1.3 交联反应温度对β-葡萄糖苷酶修饰的影响  32-33
    1.4 丝素纳米颗粒质量与酶量的比例对酶修饰的影响  33-35
      1.4.1 交联法  33-34
      1.4.2 包埋法  34-35
  2 生物结合酶的特性  35-43
    2.1 酸碱度（pH）对酶活性的影响试验  35-36
    2.2 反应温度对生物结合酶活力的影响试验  36-38
    2.3 生物结合酶的热稳定性  38-39
    2.4 生物结合酶的米氏常数Km  39-41
    2.5 生物结合酶的操作稳定性  41-43
  3 丝素纳米颗粒在食品加工中的应用  43-48
    3.1 HPLC 定量分析的柚皮苷标准曲线  43-44
    3.2 生物结合酶的柚皮苷水解脱苦试验  44-45
    3.3 反应温度对生物结合酶活力影响的试验  45-46
    3.4 柚苷酶β-丝素纳米颗粒生物结合物的操作稳定性试验  46-48
讨论  48-50
参考文献  50-58
在学期间发表论文  58-59
英汉双解缩略词表  59-60
致谢  60-61

β-葡萄糖苷酶-丝素纳米颗粒结合物的生物合成、特性及应用

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