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产金黄色葡萄球菌肠毒素A工程菌构建及其发酵条件研究

作　者: 丁岚
导　师: 陈福生；王小红
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 重组金黄色葡萄球菌肠毒素A 响应面方法条件优化间接竞争酶联免疫吸咐法
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起食物中毒和医院化脓性感染的一种重要致病菌。其致病力的大小主要取决于其所产肠毒素(staphylococcal enterotoxins, SEs)的能力。SEs是一组结构相关、毒力相近、抗原性不同、分子量为24-32 KDa的单链,且具有超抗原活性的胞外蛋白,包括肠毒素A、肠毒素B、肠毒素C等近二十种血清型。其中,以A型肠毒素(SEA)引起食物中毒的发生率最高。本研究首先构建了SEA基因重组表达菌株(E.coli BL28-rSEA),然后对其培养与表达条件进行了优化,为后续大量制备SEA标准品奠定了基础。主要研究结果如下。1重组SEA工程菌的构建与蛋白的表达、纯化从野生型金葡菌ATCC 13565中克隆SEA基因插入含有His标签的原核表达载体pET28a(+)并转化大肠杆菌,成功构建能高效表达重组SEA蛋白(recombinant staphylococcal enterotoxin A, rSEA)的工程菌E. coli BL28-rSEA.采用Ni-NTA His Bind Resin的亲和层析方法对rSEA进行分离纯化,SDS-PAGE电泳表明BL28-rSEA产生的rSEA为28 KDa的融合蛋白,与相关文献报道一致。2重组SEA工程菌的发酵条件研究采用间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay, icELISA)对rSEA产量进行定量。研究了接种量、pH、温度、诱导时机、诱导时间、乳糖诱导浓度等对工程菌BL28-rSEA产rSEA的影响。结果表明,E. coli BL28-rSEA在接种量2%、pH 7.0、温度为37℃、对数生长期(OD600约为0.6),添加终浓度为0.6 mmol/L的乳糖诱导7 h,能获得10.6 mg／L的rSEA.3rSEA工程菌的发酵培养基优化首先,采用Plackett-Burman设计对产rSEA的工程菌E. coli BL28-rSEA培养基主要成份葡萄糖、蛋白胨、甘油等进行评价,然后用最陡爬坡试验对培养基成份的最适区域进行评估,最后采用Box-Behnken设计和响应面分析对被测因子的最佳浓度进行优化。结果表明,E. coli BL28-rSEA产rSEA的最佳培养基成份为(g／L)：葡萄糖2.00,蛋白胨23.00, Na2HPO4·12H2O 21.00, NaH2PO4·2H2O 4.00,酵母浸膏2.60以及甘油36.48。在此条件下,诱导表达rSEA的产量可达33.17 mg／L,是未优化前培养基产量的1.84倍,是野生型金葡菌SEA产量的近9倍。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略语表  11-13
第一章文献综述  13-23
  1 金葡菌及其肠毒素的检测方法的研究进展  13-18
    1.1 金葡菌检测的研究进展  13-15
      1.1.1 分子生物学方法  14-15
    1.2 金葡菌肠毒素检测的研究进展  15-18
      1.2.1 生物学检测  15
      1.2.2 传统免疫分析法  15-16
      1.2.3 标记免疫分析法  16-17
      1.2.4 生物传感器技术  17-18
      1.2.5 超抗原技术  18
  2 基因工程与发酵工程进展  18-19
    2.1 基因工程  18-19
    2.2 发酵工程  19
  3 生物优化方法在发酵过程中的应用  19-21
    3.1 非统计优化技术  19-20
    3.2 统计优化技术  20-21
      3.2.1 Placket-Burman设计法  20
      3.2.2 部分因子设计法  20-21
      3.2.3 中心组合设计法  21
      3.2.4 Box-Behnken设计法  21
  4 本课题研究目的和意义  21-23
第二章 SEA基因工程菌的构建与蛋白的表达纯化  23-34
  1 引言  23
  2 材料与方法  23-30
    2.1 材料  23-24
      2.1.1 菌株和质粒  23
      2.1.2 主要试剂  23-24
      2.1.3 主要仪器与设备  24
    2.2 实验方法  24-30
      2.2.1 金葡菌基因组DNA的提取  24-25
      2.2.2 SEA基因引物设计与PCR扩增  25
      2.2.3 目的基因的亚克隆  25-26
      2.2.4 重组SEA表达质粒的构建与鉴定  26
      2.2.5 SEA融合蛋白的表达和破碎  26-27
      2.2.6 Ni-亲和层析柱纯化rSEA  27-28
      2.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  28-29
      2.2.8 透析除盐  29-30
  3 结果与分析  30-32
    3.1 SEA基因的扩增  30
    3.2 重组表达质粒的构建及酶切验证  30-31
    3.3 测序结果  31
    3.4 rSEA的诱导表达  31-32
    3.5 rSEA的亲和层析纯化  32
  4 讨论  32-34
第三章产金葡菌肠毒素A工程菌的发酵条件研究  34-47
  1 引言  34
  2 材料与方法  34-38
    2.1 材料  34-35
      2.1.1 菌株和抗血清  34-35
      2.1.2 主要试剂  35
      2.1.3 主要仪器与设备  35
    2.2 实验方法  35-38
      2.2.1 培养条件  35-36
      2.2.2 间接竞争ELISA检测rSEA方法的建立  36-38
      2.2.3 乳糖诱导最佳浓度的确定  38
  3 结果与分析  38-45
    3.1 间接非竞争ELISA法测定抗血清的效价  38-39
    3.2 抗SEA抗血清的间接竞争ELISA灵敏度分析  39-40
      3.2.1 包被抗原和抗血清最佳工作浓度的选择  39
      3.2.2 间接竞争ELISA方法标准曲线的建立  39-40
    3.3 接种量的影响  40-41
    3.4 pH对目的蛋白产量的影响  41
    3.5 温度对目的蛋白产量的影响  41-42
    3.6 诱导时机影响  42-43
    3.7 诱导后培养时间对表达的影响  43
    3.8 乳糖诱导  43-45
  4 讨论  45-47
第四章产金葡菌肠毒素A工程菌的发酵培养基优化  47-55
  1 引言  47
  2 材料和方法  47-49
    2.1 实验材料  47-48
      2.1.1 菌种  47-48
      2.1.2 培养基  48
      2.1.3 主要仪器与设备  48
    2.2 实验方法  48-49
      2.2.1 培养条件  48
      2.2.2 间接竞争ELISA检测rSEA方法  48
      2.2.3 培养基优化  48-49
  3 结果与分析  49-54
    3.1 Plackett-Burman设计法  49-50
    3.2 最陡爬坡试验设计法  50-51
    3.3 Box-Behnke试验设计筛选重要因素的最优水平  51-53
    3.4 响应面分析及最佳培养基成分确定  53-54
  4 讨论  54-55
第五章结论与展望  55-57
  1 结论  55-56
    1.1 SEA基因工程菌的构建与蛋白的表达纯化  55
    1.2 产金葡菌肠毒素A工程菌的发酵条件研究  55
    1.3 产金葡菌肠毒素A工程菌的发酵培养基优化  55-56
  2 展望  56-57
    2.1 对包涵体变性复性条件进行优化  56
    2.2 对纯化后的rSEA进行结构、功能分析及生物活性鉴定  56
    2.3 金葡菌多联融合毒素工程菌的构建  56-57
参考文献  57-67
致谢  67

产金黄色葡萄球菌肠毒素A工程菌构建及其发酵条件研究

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