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黄瓜花叶病毒基因组RNA的定量分析

作　者: 曾蓉
导　师: 黎定军；陈集双
学　校: 湖南农业大学
专　业: 分子植物病理学
关键词: 黄瓜花叶病毒小西葫芦黄化花叶病毒协生作用荧光定量PCR 番茄花叶病毒卫星RNA 相对定量绝对定量基因组RNA
分类号: S432.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)作为典型的+ssRNA病毒，是寄主最多、分布最广、对农作物危害最为严重的植物病毒之一；该病毒为三分体病毒，基因组分布在3条RNA分子上。因此基因组结构简单，是研究RNA病毒在寄主上致病机制的模式病毒之一。本文就CMV与小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)的协生作用、CMV与番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)在番茄上的互作、以CMV为辅助病毒的一卫星RNA的功能和CMV病毒粒子中各基因组RNA的绝对量进行了研究。1．黄瓜花叶病毒与小西葫芦黄化花叶病毒协生作用的研究病毒复合侵染发生在植物或动物上，被侵染组织通常表现出比单种病毒侵染更严重的症状和一种或两病毒积累量的增加。CMV和ZYMV复合侵染是植物病毒比较典型的协生作用，本研究从宏观和微观不同角度的研究了两病毒的协生关系。研究发现，两病毒复合侵染寄主后，较单独侵染时明显症状加重、病情指数(disease index，DI)增加。Real-time RT-PCR结果显示，复合侵染后两寄主的CMV-Fny各基因组都有不同程度的影响，在35 dpi，黄瓜上的CMV-Fny各ORF为单独侵染的1.48，2.24，2.51，0.99倍，瓠瓜上CMV-Fny各ORF为单独侵染的15.14，4.90，3.16，2.57倍；黄瓜和瓠瓜ZYMV的基因组RNA为单独侵染的90％和22％。本研究以real-time RT-PCR为技术平台，首次精确的量化了单独和复合侵染时各病毒RNA基因组在两种葫芦科作物上的基因时序变化，建立了一种以18S rRNA为内参照的RNA相对定量方法。2．黄瓜花叶病毒与番茄花叶病毒在番茄上的互作的研究病毒间的干扰作用也十分常见，通常表现为一病毒影响另一病毒的复制、运输、装配等。本试验有关CMV与ToMV在番茄上的互作的结果显示：在预先接种CMV-Fny的番茄植株一段时间后，植株便获得了抵抗强毒ToMV-N5侵染的能力，不表现强毒在寄主上的症状。本试验对CMV和ToMV两病毒单独、复合侵染后，寄主生物反应、生理量、病毒积累等初步的研究，为探讨CMV和烟草花叶病毒的复合侵染提供研究方法和理论基础。3．黄瓜花叶病毒卫星RNA番茄分离物的功能初步研究从浙江省湖州市番茄样品中，分离到一携带卫星RNA的CMV。本研究克隆了该卫星RNA，并且将其与CMV-Fny假重组于烟草、番茄和西葫芦中，分析该卫星的存在对辅助病毒症状的调控情况，并采用实时荧光定量PCR分析该卫星RNA对CMV-Fny各个基因组积累量的影响。试验结果显示：Tlsat能延缓或减轻CMV-Fny在烟草上的症状反应；添加卫星Tlsat后，使得CMV-Fny在番茄上症状加重；CMV-Fny和CMV-Fny+Tlsat在西葫芦上均引起花叶皱缩症状，在西葫芦中Tlsat对CMV-Fny的症状没有影响。对与Tlsat与CMV假重组后对不同寄主体内CMV各基因组RNA的定量结果检测发现：Tlsat均抑制辅助病毒在烟草和番茄基因组的积累量，但在番茄寄主中病毒基因组含量受到抑制效应更明显；而西葫芦中，CMV-Fny基因组积累量不受Tlsat的影响。我们推测CMV-Fny在寄主上的不同症状可能与病毒基因组含量不相关。4．黄瓜花叶病毒病毒粒子中各基因组RNA的绝对量的分析CMV为三分体RNA病毒，各基因组RNA分别包被于3种不同的病毒蛋白外壳内。根据以前的报道，多分体病毒各基因组RNA的量与病毒的致病性相关。本研究首先通过体外转录所得高纯度的RNA梯度稀释，建立了相应的标准曲线方程，得到病毒RNA浓度对数值(copies／μl)与荧光阈值(Ct值)成线性关系的一元回归方程；然后根据CMV-Fny病毒粒子各基因组RNA的Ct值计算得出各基因组RNA在病毒粒子种的确切拷贝数，CMV-Fny病毒粒子中各基因组RNA的量比值为，RNA1：2：3：4=1.00：(1.17±0.11)：(3.58±0.20)：(5.81±0.31)。本试验还辅以Lab-on-a-Chip和Northern blot杂交两种RNA定量的检测方法，并获得了与real-time RT-PCR一致的结果。本研究也以real-time RT-PCR为技术平台，首次精确定量了三分体病毒CMV-Fny各基因组RNA的在其病毒粒子中的比例，建立了一种用标准曲线的绝对定量方法，为多分体病毒的定量方法提供实践参考和理论依据。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第一章文献综述  13-35
  1.1 黄瓜花叶病毒  13-16
    1.1.1 黄瓜花叶病毒生物学特点  13-14
    1.1.2 黄瓜花叶病毒基因组及功能  14-15
    1.1.3 病毒株系变异及侵染力  15-16
  1.2 小西葫芦黄化花叶病毒  16-18
    1.2.1 小西葫芦黄化花叶病毒生物学特点  16-17
    1.2.2 病毒基因组及功能  17-18
  1.3 病毒的互作  18-22
    1.3.1 协生作用  18-21
    1.3.2 交互保护作用及机理  21-22
  1.4 黄瓜花叶病毒卫星RNA研究进展  22-26
    1.4.1 黄瓜花叶病毒的satRNA的结构特点  22-23
    1.4.2 黄瓜花叶病毒的satRNA的复制  23-25
    1.4.3 黄瓜花叶病毒的satRNA的对辅助病毒的症状调控  25-26
  1.5 研究目的与内容  26-28
    1.5.1 研究目的  26-27
    1.5.2 研究内容  27-28
  1.6 参考文献  28-35
第二章黄瓜花叶病毒和小西葫芦黄化花叶病毒协生作用的定量分析  35-50
  2.1 材料与方法  35-39
    2.1.1 寄主植物  35
    2.1.2 酶与试剂  35
    2.1.3 毒源  35-36
    2.1.4 病情指数  36
    2.1.5 引物设计及筛选  36-37
    2.1.6 总RNA提取  37
    2.1.7 RT-PCR扩增  37-39
  2.2 结果及分析  39-46
    2.2.1 寄主生物学差异及抗病性比较  39-40
    2.2.2 引物筛选及Real-time RT-PCR扩增特异性  40-42
    2.2.3 单独、复合侵染时CMV-Fny各开放阅读框相对量的动态变化  42-45
    2.2.4 单独、复合侵染时ZYMV-SD CP开放阅读框相对量的动态变化  45-46
  2.3 讨论  46-48
  2.4 参考文献  48-50
第三章黄瓜花叶病毒和番茄花叶病毒相互作用的定量分析  50-60
  3.1 材料与方法  50-52
    3.1.1 寄主植物  50
    3.1.2 酶与试剂  50
    3.1.3 毒源  50-51
    3.1.4 引物设计及筛选  51
    3.1.5 总RNA提取  51
    3.1.6 RT-PCR扩增  51-52
  3.2 结果及分析  52-56
    3.2.1 寄主生物学差异  52-54
    3.2.2 单独、复合侵染时两病毒各开放阅读框相对量的分析  54-56
  3.3 讨论  56-58
  3.4 参考文献  58-60
第四章黄瓜花叶病毒卫星RNA番茄分离物的功能初步研究  60-74
  4.1 材料与方法  61-64
    4.1.1 毒源和寄主植物  61
    4.1.2 酶与试剂  61
    4.1.3 双链RNA和病毒粒子的提取和分析  61-62
    4.1.4 总RNA提取  62-63
    4.1.5 RT-PCR扩增  63
    4.1.6 TlsatRNA的全长克隆  63
    4.1.7 Tlsat体外转录与接种  63
    4.1.8 CMV-Fny基因组相对定量分析  63-64
  4.2 结果及分析  64-69
    4.2.1 Tlsat的克隆测序  64-65
    4.2.2 Tlsat与CMV-Fny的假重组  65-67
    4.2.3 Tlsat对CMV-Fny在不同寄主上症状的影响  67-68
    4.2.4 TlsatRN对CMV-Fny基因组在寄主内积累量的影响  68-69
  4.3 讨论  69-72
  4.4 参考文献  72-74
第五章黄瓜花叶病毒各基因组RNA在病毒粒子中绝对量的分析  74-85
  5.1 材料与方法  74-77
    5.1.1 寄主植物  74
    5.1.2 酶与试剂  74-75
    5.1.3 毒源和病毒粒子的提取  75
    5.1.4 总RNA提取  75
    5.1.5 标准品的制作  75-76
    5.1.6 RT-PCR扩增  76
    5.1.7 Lab-on-a-Chip分析  76-77
    5.1.8 Northern blot杂交  77
  5.2 结果及分析  77-81
    5.2.1 CMV-Fny各基因组RNA在病毒粒子中的绝对定量  77-79
    5.2.2 Northern blot杂交和Lab-on-a-Chip检测结果及同real-time RT-PCR结果比较  79-81
  5.3 讨论  81-83
  5.4 参考文献  83-85
致谢  85-86
附录:重要溶液的配制  86-88
攻读硕士学位期间的研究成果  88

黄瓜花叶病毒基因组RNA的定量分析

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