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靶向核糖核酸酶抗乙肝病毒作用的研究和抗乙肝病毒机制的初步探索

作　者: 李英辉
导　师: 薛采芳；刘军
学　校: 第四军医大学
专　业: 病原生物学
关键词: 乙型肝炎病毒核衣壳导向的病毒灭活作用靶向核糖核酸酶原核表达复性前基因组RNA
分类号: R512.62
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

乙肝病毒感染是一个世界范围的卫生问题。据统计,全世界大约有3.5亿乙型肝炎病毒慢性感染者,我国约有1.2亿,其中相当大的一部分,特别是围产期/幼年期乙肝病毒感染者会迁延转变成为慢性肝炎,肝硬化或者肝癌。在过去的二十年中,虽然疫苗计划免疫降低了急、慢性乙肝病毒感染的发生率,但是现有的数目庞大的感染人群、约5%的对疫苗无应答者以及逃避疫苗诱导免疫的乙肝病毒突变株,都表明急需有效的治疗手段。对慢性乙型肝炎感染者的治疗,目前临床应用的α干扰素和核苷类似物有一定疗效,但是干扰素有效率不高(约为30%-40%),耐受性差,价格昂贵,副作用和禁忌症都较多;核苷类似物包括lamivudine、famciclovir等停药后部分患者的病情会复发,而长期用药又会导致耐药株的出现。因此,目前的治疗乙肝病毒感染的方法并不令人满意,迫切需要探索新的有效的治疗方法。近年来,随着生物技术的发展,基因治疗的研究取得了令人瞩目的成就,这也为乙型肝炎的治疗开辟了新的途径。 1991年,Natsoulis和Boeke在Nature杂志首次提出一种新的抗病毒的策略:核衣壳导向的病毒灭活(capsid-targeted viral inactivation,CTVI)并将其应用于逆转录病毒的实验治疗。乙肝病毒的复制过程类

全文目录

缩略语表  7-9
中文摘要  9-14
英文摘要  14-20
前言和文献回顾  20-51
正文  51-99
  第一部分靶向核糖核酸酶抗乙肝病毒作用进一步检测  51-63
    1 材料和方法  52-56
      1.1 材料  52
      1.2 方法  52-56
        1.2.1 细胞培养  52
        1.2.2 2.2.15细胞转染  52-53
        1.2.3 转染效率的检测  53
        1.2.4 RT-PCR检测转染基因的表达  53-54
        1.2.5 转染后2.2.15细胞内HBeAg含量测定  54
        1.2.6 转染后2.2.15细胞内HBsAg含量测定  54
        1.2.7 转染后2.2.15细胞上清中HBeAg含量测定  54-55
        1.2.8 荧光定量PCR测定HBV拷贝数  55-56
        1.2.9 统计分析  56
    2 结果  56-60
      2.1 转染效率的检测  56-57
      2.2 RT-PCR表达鉴定  57
      2.3 转染后2.2.15细胞内HBeAg含量测定  57-58
      2.4 转染后2.2.15细胞内HBsAg含量测定  58-59
      2.5 固相放免测定转染后上清中HBeAg含量  59-60
      2.6 荧光定量PCR测定转染后上清中HBV拷贝数  60
    3 讨论  60-63
  第二部分靶向核糖核酸酶抗乙肝病毒机制的初步探索  63-99
    1 HBV靶向核糖核酸酶的原核表达、纯化和复性  63-72
      1.1 材料和方法  63-68
        1.1.1 材料  63-64
        1.1.2 方法  64-68
          1.1.2.1 pET32a(+)/TR原核表达载体的构建  64
          1.1.2.2 蛋白表达纯化  64-68
          1.1.2.3 纯化蛋白的复性  68
      1.2 结果  68-72
        1.2.1 重组载体的酶切鉴定  68
        1.2.2 pET32a(+)/TR的原核表达  68-71
        1.2.3 pET32a(+)/TR的纯化和复性  71-72
    2 对照蛋白的原核表达、纯化和复性  72-85
      2.1 材料和方法  72-77
        2.1.1 材料  72
        2.1.2 方法  72-77
          2.1.2.1 对照蛋白原核表达载体的构建  72
          2.1.2.2 对照蛋白的表达和鉴定  72-74
          2.1.2.3 对照蛋白的纯化和复性  74-76
          2.1.2.4 TR，TRmut及hEDN蛋白定量和纯度分析  76
          2.1.2.5 复性后hEDN核糖核酸酶活性分析  76-77
      2.2 结果  77-85
        2.2.1 对照蛋白原核表达载体的构建和鉴定  77
        2.2.2 对照蛋白的诱导表达  77-81
        2.2.3 对照蛋白的纯化和复性  81-83
        2.2.4 TR，TRmut及hEDN蛋白定量和纯度分析  83
        2.2.5 hEDN复性效果分析  83-85
    3 TR的抗乙肝病毒机制的初步分析  85-95
      3.1 材料和方法  85-90
        3.1.1 材料  85
        3.1.2 方法  85-90
          3.1.2.1 TR核糖核酸酶活性分析  85-87
            3.1.2.1.1 TR核糖核酸酶活性的定性分析  85-87
            3.1.2.1.2 TR核糖核酸酶活性的定量分析  87
          3.1.2.2 TR靶向性分析  87-90
            3.1.2.2.1 细胞外实验分析TR靶向性  87-90
            3.1.2.2.2 细胞内实验分析TR的靶向性  90
      3.2 结果  90-95
        3.2.1 HBV TR核糖核酸酶活性的定性分析  90-91
        3.2.2 TR，TRmut及hEDN核糖核酸酶活性的定量分析  91-93
        3.2.3 TR靶向性分析  93-95
          3.2.3.1 细胞外实验分析TR靶向性  93-94
          3.2.3.2 细胞内实验分析TR靶向性  94-95
    4 讨论  95-99
小结  99-100
参考文献  100-103
个人简历和研究成果  103-105
致谢  105

靶向核糖核酸酶抗乙肝病毒作用的研究和抗乙肝病毒机制的初步探索

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