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金黄色葡萄球菌GapC蛋白的表达与免疫原性研究

作　者: 朱洪伟
导　师: 崔玉东；朱战波
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 金黄色葡萄球菌 GapC蛋白兔免疫
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 99次
引　用: 1次
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内容摘要

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus, S. aureus)是引起人和动物多种疾病的重要致病菌。由于不同S. aureus菌株间缺乏共同的保护性抗原,目前研究的S. aureus疫苗在临床试验中应用效果并不理想。研究表明甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)蛋白可作为抗寄生虫和微生物感染的疫苗抗原。因而,本研究利用S. aureus表面具有GAPDH活性的保守性GapC蛋白制备免疫原,探讨其免疫原性,及其对S. aureus感染的免疫保护作用。本研究首先通过PCR方法扩增S. aureus菌株BMSA/855/23-1的gapC基因,随后将其克隆到pMD18-T载体上。重组克隆pMD-T/gapC经测序后,与GenBank上已发表的序列进行对比分析。然后,将gapC基因插入到pQE-30载体上,构建重组质粒pQE30/gapC。重组质粒转化大肠杆菌E.coli M15(pREP4),IPTG诱导后,SDS-PAGE鉴定GapC融合蛋白的表达。重组蛋白经纯化后进行GAPDH活性检测和Western blot检测,确定其GAPDH活性及特异性抗体结合活性。25只健康家兔随机分成5组,分别用重组蛋白、全菌体灭活菌苗及对照剂(PBS)对其进行免疫。应用ELISA方法检测血清中IgG抗体水平及加强免疫第14d血清中IFN-γ、IL-4细胞因子浓度。最后,用S. aureus菌株Wood46对免疫兔攻毒,观察攻毒后家兔的临床症状、病理变化,对试验兔的肝、脾及肾脏进行细菌分离鉴定,确定其发病情况,进而评价GapC蛋白的免疫保护效果。结果本研究成功扩增并克隆了S. aureus BMSA/855/23-1株的gapC基因,该菌株的gapC基因与GenBank上S. aureus BM10株的核苷酸序列一致性为99.3%,推导氨基酸序列一致性为99.4%。SDS-PAGE结果表明,重组质粒pQE30/gapC在E. coli M15(pREP4)中成功表达,GAPDH活性检测及Western Blot检测表明重组蛋白具有较高的GAPDH活性和抗原性。GapC蛋白及全菌体组兔血清中抗IgG抗体水平在加强免疫后第28d达到最高(1:64000)。加强免疫后第14d血清中细胞因子IFN-γ和IL-4浓度与对照组相比,显著升高(p<0.05);而全菌体免疫组细胞因子浓度升高不明显(p>0.05)。在加强免疫第10d,用5×107CFU/mL S. aureus对家兔进行攻毒,结果蛋白免疫组家兔中仅有1只家兔发病(1/5)。以上结果表明,表达的重组GapC蛋白具有GAPDH活性、免疫原性及较好的免疫保护力。可作为深入研究S. aureus基因工程疫苗的良好靶向。

全文目录

中文摘要  6-7
Abstract  7-10
第一章文献综述  10-20
  1.1 引言  10
  1.2 S. aureus 的致病机制  10-12
  1.3 S. aureus 疫苗的研究进展  12-14
  1.4 S. aureus Gap 的特性与应用  14-16
  1.5 GAPDH 的新功能  16-19
  1.6 小结  19-20
第二章材料与方法  20-29
  2.1 材料  20-21
  2.2 方法  21-29
第三章结果  29-40
  3.1 S. aureus gapC 基因的PCR 扩增结果  29
  3.2 S. aureus gapC 基因的T-A 克隆及序列测定结果  29-32
  3.3 gapC 基因重组表达载体的构建结果  32-33
  3.4 重组GapC 蛋白的表达及纯化结果  33-34
  3.5 重组GapC 蛋白的GAPDH 活性测定结果  34
  3.6 重组GapC 蛋白的Western Blot 结果  34-35
  3.7 重组GapC 蛋白的免疫效果  35-37
  3.8 GapC 重组蛋白的免疫保护结果  37-40
第四章讨论  40-43
第五章结论  43-44
参考文献  44-50
致谢  50-51
附录  51-59
个人简历  59-60

金黄色葡萄球菌GapC蛋白的表达与免疫原性研究

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