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NMDA受体在新生大鼠高氧性肺损伤后肺泡发育受阻及肺组织胶原沉积中的作用及机制探讨

作　者: 邓晓丹
导　师: 岳少杰
学　校: 中南大学
专　业: 儿科
关键词: 高氧 肺损伤 CLD N-甲基-D-天冬氨酸受体 细胞因子
分类号: R722.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


研究背景氧疗是改善机体缺氧状态的一项重要措施，但长时间吸入高浓度氧（简称高氧）会导致不同程度的急慢性肺损伤。新生儿期是正常肺泡成熟的关键期，长期吸入高浓度氧可导致以弥漫性肺泡损害伴炎症细胞浸润为特征的急性肺损伤及以肺泡发育受阻和纤维化增生为主的慢性肺损伤（chronic lung disease CLD）。CLD的发生一般认为与早产、宫内感染、炎症、氧中毒、气压伤和营养等多种因素有关，吸入高浓度氧引起的氧化应激与其发生密切相关。虽然CLD的发病机制尚不清楚，但由细胞因子介导的肺炎性反应在CLD发生中的作用已被大量的临床和动物实验所证实，并且高氧诱导细胞因子表达的机制可能与核因子NF-κB的激活有关。NF-κB是一类能与多种基因启动子部位κB位点发生特异性结合并促进转录的蛋白质的总称。活化的NF-κB能与DNA特定的κB位点结合，启动和调节众多参与炎症和免疫反应有关的基因转录，在机体的免疫应答，炎症反应及细胞的生长发育中起重要作用，并参与高氧性肺损伤的发生。体内外研究均证明，高氧通过一系列激活连锁反应使NF-κB移位活化，参与调控多种细胞因子、炎性介质、粘附分子、NO、细胞凋亡蛋白等的基因表达，进而促进炎症反应和细胞损伤导致高氧性肺损伤的发生和发展。转化生长因子—β（transforming growth factor—beta，TGF-β）是一类重要的生长调节因子，在组织的发生、发育及损伤后修复中发挥着重要作用。活化的TGF-β1过度表达对肺组织病理改变的影响非常显著，特别是致肺纤维化方面。由于碱性成纤维生长因子（basicfibroblast growth factor，bFGF）可促进成纤维细胞的增生和胶原纤维的合成而被认为是另一个与肺纤维化有关的细胞因子。有实验证明，高氧可诱导TGF-β1及bFGF释放增加，提示可能在高氧所致的纤维性肺泡炎症及后期的肺泡发育受阻和肺组织纤维化中起有重要的作用，但有待进一步的证明。目前NMDA受体对持续高氧暴露下肺损伤后肺泡发育受阻和肺组织胶原沉积有何影响，及与高氧暴露下肺组织中NF-κB活性、TGF-β1和bFGF含量变化有何关系尚不清楚，还有待进一步阐明。实验分为两部分：第一章MK-801对持续高氧暴露下新生大鼠肺损伤的保护作用目的观察NMDA受体拮抗剂MK-801对持续高氧暴露下新生大鼠肺损伤及损伤后胶原沉积和肺泡发育的保护作用。方法孕22天顺产分娩新生大鼠出生后12小时内编号并随机分为四组：空气对照组，空气+MK-801组，高氧组，高氧+MK-801组。空气+MK-801组和高氧+MK-801组分别每天腹腔注射MK-8010.05mg／kg，空气对照组和高氧组以同样方法接受等量生理盐水。高氧组与高氧+MK-801组置于有机玻璃箱中，持续输入≥95％O2，用钠石灰吸收CO2，使CO2浓度≤5％；空气对照组和空气+MK-801组置于同一室内，接受常压空气。分别在实验后第7天、第14天处死动物，部分动物行支气管肺泡灌洗，取灌洗液细胞计数、测定蛋白含量及LDH、MDA含量；部分未灌洗动物取肺分别进行肺组织的W（湿重）／D（干重）的比值测定、病理学HE染色、Masson染色、辐射状肺泡计数（RAC值）；部分未灌洗动物取肺进行实时荧光定量PCR检测前Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA水平，生化试剂盒测定肺组织羟脯氨酸（HYP）含量。结果1．存活率高氧暴露7天后新生大鼠的存活率明显降低，MK-801可明显提高持续高氧暴露7天新生大鼠的存活率（P＜0.05），但对持续高氧暴露14天新生大鼠的存活率无明显改善（P＞0.05）。2．BALF中白细胞计数及分类持续高氧暴露7天时高氧组及高氧+MK-801组白细胞计数和中性粒细胞、单核巨噬细胞计数均明显高于空气对照组和空气+MK-801组（P均＜0.01），以中性粒细胞的增加占优势；随着高氧暴露时间延长，至高氧第14天时，单核巨噬细胞计数及所占比例逐渐增高（P＜0.05）。MK-801可降低持续高氧暴露7天及14天BALF中白细胞总数和中性粒细胞、单核巨噬细胞计数的升高（P均＜0.01）。3．BALF中蛋白、LDH和MDA含量持续高氧暴露7天后高氧组BALF中蛋白、LDH和MDA的含量明显高于空气对照组和空气+MK-801组（P均＜0.01）；至高氧暴露14天时高氧组BALF中蛋白、LDH和MDA的含量反较7天时降低（P均＜0.01），但仍然高于空气对照组和空气+MK-801组（P均＜0.01）。MK-801可明显抑制持续高氧暴露下BALF中蛋白、LDH和MDA含量的增加（P均＜0.01）。4．肺组织湿干重（W／D）比值持续高氧暴露7天时，高氧组肺组织W／D比值明显高于空气对照组及空气+MK-801组（P均＜0.01）；高氧暴露至14天时，肺组织W／D比值有下降的趋势，但仍高于空气组和空气+MK-801组（P均＜0.01）。MK-801可降低持续高氧暴露所致的W／D比值的增加（P＜0.01，P＜0.05）。5．肺组织中羟脯氨酸（HYP）含量持续高氧暴露7天时，高氧组肺组织中HYP含量明显高于空气对照组及空气+MK-801组（P均＜0.01）；随着暴露时间延长，高氧组肺组织HYP含量持续增高（P均＜0.01）。MK-801可降低持续高氧暴露所致的HYP含量的增加（P均＜0.05）。6．肺组织中前Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA水平持续高氧暴露7天时，前Ⅰ型胶原mRNA水平虽较空气组和空气+MK-801组增高，但差异无显著性意义（P＞0.05）；随着高氧暴露时间的延长其水平进一步增加，至高氧暴露14天时即明显高于空气组和空气+MK-801组（P均＜0.01）。而前Ⅲ型胶原mRNA水平变化和前Ⅰ型胶原相反，在高氧暴露7天时，即明显高于空气组和空气+MK-801组（P均＜0.01），随后却逐渐下降，至高氧暴露14天时虽仍高于空气组和空气+MK-801组（P均＜0.01），但较7天时已明显下降（P＜0.01）。MK-801可抑制持续高氧暴露7天及14天时前Ⅲ型胶原mRNA水平的增加（P均＜0.01），以及抑制持续高氧暴露14天时前Ⅰ型胶原mRNA水平的增加（P均＜0.05）。7．肺组织形态学肉眼观察：空气对照组和空气+MK-801组肺组织无明显异常，肺叶呈粉红色。持续高氧暴露7天后，肺组织苍白肿胀，表面可见斑片状出血，高氧暴露14天时，肺组织仍苍白，但肿胀已不明显，严重者可见肺梗死性出血灶及肺实变。MK-801可减少肺组织肿胀及表面出血面积。光学显微镜改变：持续高氧暴露7天时，可见肺泡内出血、间质水肿、炎症细胞浸润、间质细胞明显增加，肺组织正常结构局灶性破坏，终末气腔明显扩张、小肺泡数量减少，持续高氧暴露14天时，肺间隔进一步增宽，出现小灶或多灶状实变，肺组织正常结构完全破坏，终末气腔扩张更为明显、小肺泡数量更少。MK-801可减少高氧暴露7天及14天后肺组织炎性渗出、使肺组织结构紊乱减轻，并改善肺泡化程度。单独应用MK-801对肺组织不产生形态学上的改变。8．辐射状肺泡计数（RAC值）持续高氧暴露7天时，高氧组RAC值明显低于空气对照组及空气+MK-801组（P均＜0.01），至高氧暴露第14天时，高氧组RAC值降低更为明显（P均＜0.01）。MK-801可抑制持续高氧暴露所致的RAC值的降低，但仍然低于空气组和空气+MK-801组（P均＜0.01）。9．肺组织Masson染色高氧暴露第7天时高氧组肺间质有少量蓝色胶原纤维增生，面积百分比高于空气组，差异具有显著性（P＜0.05），随着高氧暴露氧时间的延长至14天时肺组织胶原纤维增多增粗，主要沉积在肺间质，面积百分比较7天时明显增加（P＜0.01），并显著高于空气组及空气+MK-801组（P＜0.01）。MK-801可显著减少高氧所致肺组织胶原面积的增加（P＜0.01）。结论新生SD大鼠生后持续吸入≥95％高浓度氧可引起肺组织急性炎性损伤改变。随着高氧暴露时间的延长，新生大鼠高氧性肺损伤由早期的急性肺泡炎发展为后期的肺泡发育障碍及肺组织胶原组织的大量沉积。谷氨酸及其NMDA受体在高氧所致急慢性肺损伤的发生发展中起了重要作用。特异性谷氨酸NMDA受体阻断剂MK-801可有效减轻持续高氧暴露后不同时期的肺损伤，改善持续高氧暴露引起的肺泡发育障碍，并减轻高氧性肺损伤后肺组织胶原沉积。第二章NMDA受体介导新生大鼠高氧性肺损伤后肺组织胶原沉积及肺泡发育受阻的机制探讨目的观察MK-801对高氧暴露下新生大鼠肺组织TGF-β1、bFGF及NF-κB表达的影响，进一步阐明NMDA受体激活在高氧性肺损伤后肺泡发育受阻及肺组织胶原沉积中的作用及机制，为高氧所致慢性肺损伤的防治研究开辟新的途径。方法孕22天顺产分娩新生大鼠出生后12小时内分组并接受高氧（同第一章）。分别在实验后第7天、第14天处死动物，部分动物取肺进行实时荧光定量PCR检测TGF-β1、bFGF mRNA水平，ELISA试剂盒测定肺组织匀浆中TGF-β1、bFGF含量；部分动物取肺进行NF-κB免疫组化染色。结果1．肺组织中TGF-β1mRNA水平及蛋白含量持续高氧暴露可导致肺组织中TGF-β1 mRNA水平的增加，高氧暴露7天时，高氧组肺组织TGF-β1mRNA水平明显高于空气组和空气+MK-801组（P均＜0.01），高氧暴露14天时增高较空气组和空气+MK-801组更为明显（P均＜0.01）；持续高氧暴露下肺组织TGF-β1蛋白含量与mRNA水平变化具有一致性。MK-801可降低持续高氧暴露7天及14天TGF-β1mRNA水平及蛋白含量的增加（P均＜0.01）。2．肺组织中bFGFmRNA水平及蛋白含量持续高氧暴露可导致bFGF mRNA水平的增高，至高氧暴露14天时高氧组肺组织bFGF mRNA水平显著高于空气组和空气+MK-801组（P均＜0.01）；持续高氧暴露下肺组织bFGF蛋白含量与mRNA水平变化具有一致性。MK-801可抑制高氧暴露14天时bFGFmRNA水平及蛋白含量的增加（P＜0.05，P＜0.01）。3．肺组织NF-κB表达高氧暴露7天时，高氧组肺组织细胞核明显阳性着色，而胞浆阳性着色少，与空气组、空气+MK-801组比较差异有显著性（P均＜0.01）；持续高氧暴露14天时，高氧组胞核着色仍持续强于空气组及空气+MK-801组（P均＜0.01），MK-801可减轻不同高氧暴露时间所致的NF-κB表达的增加（P均＜0.01）。结论高氧暴露可促进新生大鼠肺组织NF-κB蛋白的表达和激活，上调TGF-β1和bFGF的表达，从而导致高氧性肺损伤后肺泡发育受阻和肺组织胶原沉积。谷氨酸NMDA受体阻断剂MK-801可抑制持续高氧暴露所致新生大鼠肺组织NF-κB蛋白的表达和激活，下调TGF-β1及bFGF的表达。从而减轻高氧性肺损伤后肺泡发育受阻及肺组织胶原沉积的发生。

全文目录


中文摘要  4-10
英文摘要  10-17
缩写词表  17-18
前言  18-20
第一章 MK-801对持续高氧暴露下新生大鼠肺损伤的保护作用  20-50
  1.1 材料  20-21
  1.2 方法  21-27
  1.3 实验流程图  27
  1.4 结果  27-44
  1.5 讨论  44-49
  1.6 结论  49-50
第二章 NMDA受体介导新生大鼠高氧性肺损伤后肺泡发育受阻及肺组织胶原沉积的机制探讨  50-67
  2.1 材料  51
  2.2 方法  51-56
  2.3 实验流程图  56
  2.4 结果  56-61
  2.5 讨论  61-66
  2.6 结论  66-67
附图  67-72
参考文献  72-80
综述  80-94
致谢  94-95
在读期间研究成果  95

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中图分类: > 医药、卫生 > 儿科学 > 新生儿、早产儿疾病 > 新生儿疾病
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