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复苏促进因子Rpf对淡水浮游细菌可培养性的影响

作　者: 柳云帆
导　师: 谢建平
学　校: 西南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 复苏促进因子浮游细菌可培养性活的但不可培养状态信号分子
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

自然环境中大量微生物处于VBNC（Viable but Nonculturable）状态，实验室中微生物的可培养性通常不足1％。造成微生物可培养性低的原因很多，其中一个主要的原因是实验室条件下缺乏细胞间交流的信号因子。过低的可培养性已经成为筛选新型天然活性产物的瓶颈。革兰氏阴性菌通常采用小分子化合物作为细胞与细胞间交流的信号分子。在培养基中加入QS（Quorum Sensing）信号系统中的酰基高丝氨酸环内酯（N-acyl homoserine lactones，AHLs）和参与大多数革兰氏阴性菌基因调控的cAMP均能有效提高海水和淡水中浮游细菌的可培养性。但作为生物活性物质重要来源的放线菌属于革兰氏阳性菌，而革兰氏阳性菌通常使用寡肽作为信号分子。复苏促进因子Rpf（Resuscitation promoting factor）是第一个被发现的细菌的细胞因子，在皮摩尔浓度下便能促进休眠期的细菌复苏和生长。Rpf家族蛋白广泛分布于革兰氏阳性菌中，高度保守并具有种间活性。本文通过在大肠杆菌中克隆表达结核分枝杆菌H₃₇Rv rpfC，经IPTG诱导，Ni²⁺ Sepharose纯化可溶性重组蛋白；同时制备藤黄微球菌在LMM培养基中对数生长中后期上清（含天然Rpf）。纯化后的rRpfC及藤黄微球菌上清均能显著缩短休眠状态的藤黄微球菌低密度接种（100cells／mL）到基本培养基（LMM）中的延滞期。在重庆北碚缙云山黛湖采集水样，测定样品非生物因素：温度15.8℃，pH 7.38，TOC 4.91mg／mL，COD_cr27.5mg／mL。部分水样2％戊二醛固定，PI染色，荧光显微镜535nm激发波长下观察计算得出黛湖浮游细菌含量为1.29x10⁶cells／ml。将样品做10倍梯度稀释，MPN法测得添加rRpfC及藤黄微球菌上清后水样中浮游细菌可培养数量约占细菌总数的0.2％，与对照相当。通过改良的试剂盒法抽提宏基因组DNA及MPN法培养后的细菌总DNA，PCR扩增16S rDNA V3—V5区，DGGE指纹图谱分析发现添加Rpf后细菌多样性增加，添加rRpfC及藤黄微球菌上清有一定差异。通过Rpf介导提高环境微生物的可培养性，有望筛选到之前未曾培养的新菌种，进而筛选新型天然活性产物。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
第一章综述  7-17
  1.1 环境中VBNC状态微生物  7-11
  1.2 复苏促进因子Rpf(Resuscitation promoting factor)  11-17
第二章绪论  17-18
第三章实验材料和方法  18-27
  3.1 实验材料  18-19
  3.2 试验方法  19-27
第四章实验结果  27-36
  4.1 rpfC基因的扩增和克隆  27-28
  4.2 重组RpfC的表达与纯化  28-29
  4.3 重组质粒及IPTG对宿主菌的影响。  29
  4.4 重组RpfC蛋白及M.luteus上清生物活性的测定  29
  4.5 黛湖非生物因素  29-30
  4.6 黛湖的细菌数量  30
  4.7 黛湖未培养及经过MPN法培养后微生物基因组的抽提  30
  4.8 宏基因组16S rDNA V3～V5片段的扩增  30
  4.9 黛湖秋冬季节间浮游细菌多样性考察  30-32
  4.10 MPN法检测Rpf对黛湖可培养浮游细菌数的影响  32-35
  4.11 DGGE指纹图谱分析Rpf对黛湖可培养浮游细菌多样性影响  35-36
第五章讨论与分析  36-39
  5.1 Mycobacterium tuberculosis H37Rv株RpfC的表达与纯化  36
  5.2 Rpf蛋白的生物活性  36-37
  5.3 环境样本的选择  37
  5.4 宏基因组抽提方法改良  37-38
  5.5 可培养细菌的数量与多样性  38-39
第六章结论与展望  39-40
参考文献  40-45
致谢  45

复苏促进因子Rpf对淡水浮游细菌可培养性的影响

内容摘要

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