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东平湖浮游细菌群落多样性分析

作　者: 李正华
导　师: 丁延芹；汪光义
学　校: 山东农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 浮游细菌多样性环境影响末端限制性片段长度多态性 16S rRNA克隆文库变性梯度凝胶电泳
分类号: Q938.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

东平湖是一个典型的温带浅水湖泊,来自大汶河的河水和营养物质注入东平湖,同时东平湖的湖水流入黄河。它的生态系统还受到了来自淀粉厂的污染物和营养物,以及水产养殖活动的严重影响。东平湖独特的环境特性,使它成为研究不同环境因素影响淡水湖泊中的浮游细菌群落的变化的理想模型。本研究根据环境变化,在东平湖布置5个采样点,分别在枯水期(2008年3月)、丰水期(2008年7月)和平水期(2008年10月)三个时期采集样品。首先测定了样品的理化性质,并用末端限制性片段长度多态性分析技术(T-RFLP)﹑16S rRNA基因文库﹑变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析了湖水细菌群落组成,探讨了浅水富营养化湖泊空间和时间上浮游细菌群落多样性和组成的变化,利用统计学方法SAS和CANOCO分析了细菌群落与理化性质指标之间的关系。结果表明各样品之间存在着显著的理化性质差异,16S rRNA基因文库结果显示样品中存在着不同的浮游细菌群落,共包括10个门:变形菌门(Alpha-, Beta- Gamma-, Delta-和Epsilon-),蓝细菌门,拟杆菌门,放线菌门,疣微菌门,厚壁菌门,浮霉菌门,芽单胞菌门,衣原体及未分类细菌等。5个采样点之间的浮游细菌群落和多样性存在着显著的差异,其中淀粉厂(A点)和河水入湖口(E点)两个样品细菌多样性较低。T-RFLP结果显示各样品有着不同的峰,但同一时期的样品存在共同的峰,说明不同时期样品间多样性的差异明显。利用软件Bio-dap计算样品的香农指数H和物种均度E,淀粉厂排污口附近样品多样性最低。DGGE结果显示样品间的条带差异明显,样品的多样性差异明显。在我们的研究中, Beta变形菌门,拟杆菌门,放线菌和蓝细菌与一些理化特性有显着的相关性。Beta变形菌门丰度与叶绿素,总磷,总钾显著相关。拟杆菌门和放线菌门丰度分别与总钾,总磷相关。此外,蓝细菌的丰富度与硝酸盐和总磷的浓度相关。典型相关性分析表明,总磷,总钾,叶绿素和硝酸盐的浓度变化解释了不同样品中的浮游细菌组成的变化。我们的研究结果表明,不同的环境因素例如营养物和污染物等的投入,水产养殖活动等,导致湖水理化性质和浮游细菌群落结构的时间和空间的变化。

全文目录

摘要  9-11
Abstract  11-13
1 前言  13-29
  1.1 东平湖概况  13-15
    1.1.1 东平湖地理位置  13-14
    1.1.2 东平湖水文概况  14-15
  1.2 湖泊微生物多样性研究进展  15-19
    1.2.1 微生物多样性涵义  15
    1.2.2 湖泊微生物多样性  15-19
  1.3 微生物多样性研究方法  19-27
    1.3.1 传统方法  19
    1.3.2 分子生物学方法  19-20
    1.3.3 环境样品基因组DNA 的提取与纯化  20-21
    1.3.4 16S rRNA 的结构及性质  21-22
    1.3.5 聚合酶链式反应（PCR）  22
    1.3.6 基于PCR 技术的研究方法  22-27
  1.4 选题依据  27-29
2 材料与方法  29-44
  2.1 实验材料  29-30
    2.1.1 采样位点  29-30
    2.1.2 采样时间  30
    2.1.3 样品编号  30
  2.2 试剂﹑仪器设备  30-34
    2.2.1 主要仪器设备  30-31
    2.2.2 生化试剂  31-32
    2.2.3 PCR 引物  32-33
    2.2.4 分析软件  33-34
  2.3 实验方法  34-44
    2.3.1 样品采集  34
    2.3.2 湖水理化性质分析  34
    2.3.3 吖啶橙染色直接计数法(AODC)分析  34-35
    2.3.4 湖水样品DNA 的提取与纯化  35-36
      2.3.4.1 提取基因组总DNA  35
      2.3.4.2 琼脂糖凝胶电泳  35
      2.3.4.3 DNA 浓度的确定  35-36
    2.3.5 T-FFLP 分析  36-38
      2.3.5.1 用于T-FFLP 的PCR 扩增  36
      2.3.5.2 PCR 产物的纯化  36-37
      2.3.5.3 PCR 产物的限制性内切酶酶切  37
      2.3.5.4 酶切产物的基因扫描  37
      2.3.5.5 T-RFLP 分析方法  37-38
    2.3.6 16S rRNA 基因文库的构建与分析  38-41
      2.3.6.1 用于16S rRNA 基因文库构建的PCR 扩增  38
      2.3.6.2 PCR 产物的纯化  38
      2.3.6.3 感受态细胞Escherichia coli DH5α的制备（CaCl2 法）  38-39
      2.3.6.4 16S rRNA 基因文库的构建  39
      2.3.6.5 菌液PCR 检测阳性克隆  39
      2.3.6.6 16S rRNA 基因文库的RFLP 分析  39-40
      2.3.6.7 DNA 测序  40
      2.3.6.8 系统发育分析  40
      2.3.6.9 克隆文库多样性分析方法  40-41
    2.3.7 DGGE 分析  41-44
      2.3.7.1 用于DGGE 的PCR 扩增  41-42
      2.3.7.2 PCR 产物的纯化  42
      2.3.7.3 DGGE 电泳  42
      2.3.7.4 Quantity One 软件包分析  42-44
3 结果与分析  44-68
  3.1 湖水理化性质  44-45
  3.2 AODC  45-47
  3.3 湖水微生物总DNA 提取  47
  3.4 T-RFLP 分析  47-50
    3.4.1 用于T-RFLP 的PCR 扩增  47-48
    3.4.2 T-RFLP 图谱  48-49
    3.4.3 样品的多样性比较  49-50
  3.5 16S rRNA 基因文库的构建  50-62
    3.5.1 用于16S rRNA 基因文库构建的PCR 扩增  50
    3.5.2 细菌16S rRNA 克隆文库构建  50-51
    3.5.3 细菌16S rRNA 扩增片段的限制性酶切分析  51-52
    3.5.4 测序结果分析  52-55
    3.5.5 浮游细菌群落的丰度和物种均度  55
    3.5.6 系统发育分析  55-62
  3.6 DGGE  62-65
    3.6.1 DGGE 图谱分析  62-63
    3.6.2 Quantity One 软件分析  63-65
  3.7 相关性分析  65-68
4 讨论  68-73
  4.1 微生物多样性时间性差异  69
  4.2 微生物多样性空间性差异  69
  4.3 各类微生物的分析  69-71
  4.4 分子生物学方法之间的比较  71
  4.5 几点建议  71-73
参考文献  73-85
附录  85-99
致谢  99-100
攻读学位期间发表论文情况  100

东平湖浮游细菌群落多样性分析

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