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神经胶质细胞和胶质瘤细胞中脂肪酸β-氧化和胆固醇代谢相关基因mRNA的表达

作　者: 石芸
导　师: 姜玲玲
学　校: 河北医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 神经胶质细胞 脑胶质瘤 过氧化物酶体 D-双功能蛋白 胆固醇代谢
分类号: Q343
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


目的:极长链脂肪酸(VLCFA)是对细胞有毒的物质,经过氧化物酶体β-氧化途径分解解毒。途经中的酶缺陷的病人,以及该酶基因敲除的大鼠,VLCFA都在脑中积聚,影响神经元的迁移,引起脱髓鞘,对神经系统产生毒性,从而导致新生儿脑畸形或脑发育不良。高胆固醇也是阿尔茨海默病发生发展的危险因素。但是,目前对中枢神经系统(CNS)中的脂肪酸和胆固醇代谢还知之甚少,因而研究组成脑组织的胶质细胞中与脂肪酸、胆固醇代谢相关基因的表达具有重要的理论和实际意义。脂肪酸β-氧化主要在线粒体和过氧化物酶体中进行。线粒体主要氧化短链和中长链的脂肪酸。肉碱脂酰转移酶Ⅰ(CPT-1)是线粒体脂肪酸β-氧化的限速酶。过氧化物酶体主要氧化VLCFA。参与过氧化物酶体脂肪酸β-氧化的酶包括脂酰CoA氧化酶1(Acox1)、脂酰CoA氧化酶2(Acox2)、脂酰CoA氧化酶3(Acox3)、L-双功能蛋白(LBP)、D-双功能蛋白(DBP)、硫解酶A(THLA)、硫解酶B(THLB)和固醇携带蛋白x(SCPx)。研究表明Acox1、DBP和THLA在大鼠脑组织有表达,其中DBP在神经元表达。神经胶质细胞是神经细胞中的重要群体,起营养、支持和协助神经元的作用。脑胶质瘤是起源于神经胶质细胞的肿瘤。在大脑组织表达的与脂肪酸代谢有关的基因,是否在胶质细胞中有表达?与过氧化物酶体脂肪酸β-氧化相关的酶的基因中有哪些基因也在神经胶质细胞表达?胶质瘤细胞中这些相关基因的表达是否与胶质细胞一样?未见报道。调节细胞内脂肪酸代谢的过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)在神经元有表达,但在胶质细胞是否有表达?未见报道。因此,本实验在成功培养皮质神经胶质细胞的基础上,分别测定了胶质细胞和胶质瘤细胞中PPARα、CPT-1、Acox1、Acox2、Acox3、DBP、LBP、THLA、THLB、SCPx mRNA的表达,以探讨脂肪酸在神经胶质细胞和胶质瘤细胞中的代谢机制和神经胶质细胞在CNS中的功能。成年鼠脑的胆固醇主要在胶质细胞内合成,羟甲基戊二酸单酰CoA还原酶(HMGR)是胆固醇合成的限速酶。胶质细胞内的胆固醇与其细胞膜上ATP结合盒转运体A1(ABCA1)结合,被呈递到胞外载脂蛋白上。神经元膜上B类Ⅰ型清道夫受体(SR-BI)摄入载脂蛋白上的胆固醇。神经元内,胆固醇24S-羟化酶(CYP46)可催化胆固醇生成24S-羟胆固醇,进而通过血脑屏障进入血液循环,入肝转化成胆汁酸后排出体外。调节胆固醇代谢的肝X受体(LXRα)也在脑组织中表达。我室以前的研究也表明,在脑组织中表达的LXRα、HMGR、CYP46、ABCA1和SR-BI基因,既在神经元也在神经胶质细胞中表达。但在胶质瘤细胞中这些基因的表达如何?未见报道。鉴于此,我们测定了原代培养的神经胶质细胞和胶质瘤细胞中LXRα、HMGR、CYP46、ABCA1和SR-BI转录的表达水平,以探讨胶质瘤细胞中胆固醇的代谢机制,为研究脂类代谢与胶质瘤的关系奠定基础。方法:1皮质神经胶质细胞的原代培养取新生3天的SD大鼠断头取脑置DMEM中。钝性剥出皮质并将皮质剪成1mm3小块,移入消化液(0.125%胰蛋白酶,pH 7.4 PBS配制)中,放入37℃培养箱中消化30min。待组织块下沉后弃去上清,加入等体积种植液(含10%标准胎牛血清和100u/ml青、链霉素的DMEM)终止消化10min并洗涤两次。再加入等体积种植液,用尖端经火焰刨光的Pasteur吸管缓慢吹打25次左右使组织团块完全消失,吸出上层单细胞悬液,计数,调整细胞密度为1×106/ml,接种于L-多聚赖氨酸处理的6孔培养板中,每孔1ml。置37℃,5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱培养。以后每3天换培养液(含10%标准胎牛血清和100u/ml青、链霉素的DMEM)一次。2 C6细胞的培养用RPMI1640培养液常规传代培养,取第10～15代细胞用于本实验。3分组分为神经胶质细胞组(Glia)和胶质瘤细胞组(C6)。4皮质神经胶质细胞的鉴定用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体进行免疫细胞化学染色来鉴定胶质细胞的性状与纯度。5细胞总RNA的提取用Trizol一步法提取。6 mRNA表达的定量用GAPDH作为内参照,利用RT-PCR法测定原代培养的胶质细胞和胶质瘤细胞中PPARα、LXRα、CPT-1、CAT、Acox1、Acox2、Acox3、DBP、LBP、THLA、THLB、SCPx、HMGR、CYP46、ABCA1和SR-BI的相对表达量。结果:1皮质神经胶质细胞的形态学观察相差显微镜下观察,细胞在接种12h后大部分贴壁,圆形或椭圆形,光晕明显,部分细胞有小突起伸出,细胞分散均匀。培养第3～4 d,细胞生长迅速,形成群落,可见较多的核分裂相,细胞体积和数量增加,突起增多,单个的胶质细胞胞体较大,胞核明显,呈圆形或卵圆形,偏于胞体一侧,周围可见混杂生长的少数神经元。培养第6～7 d,星形胶质细胞呈现出多边形和纤维形两种形态,群落之间开始融合成片,形成以星形胶质细胞为主的地毯样地层。随着培养时间延长,神经元开始退化并漂浮于培养液中。培养第13～14 d,少突胶质细胞开始生长,体积小,折光性强,有细小突起沿胞体呈放射状分布,位于表层,而底层的星形胶质细胞群落之间完全融合并铺满板底。2免疫细胞化学染色用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体进行免疫细胞化学染色来鉴定胶质细胞的性状与纯度,结果表明星型胶质细胞占培养细胞的85%,能够满足我们的实验要求。3细胞中CAT mRNA相对表达量的变化Glia组和C6组均有CAT mRNA的表达;且两组间的差别(2.406±0.318 vs 2.578±0.221)无统计学意义(P>0.05)。表明胶质细胞和胶质瘤细胞中都存在过氧化物酶体。4细胞中CPT-1 mRNA相对表达量的变化Glia组和C6组均有CPT-1 mRNA的表达;C6组CPT-1 mRNA的相对表达量(2.371±0.294)明显高于Glia组(1.364±0.232,P <0.01)。表明胶质瘤细胞中线粒体β-氧化高于胶质细胞。5细胞中Acox1、Acox2和Acox3 mRNA相对表达量的变化Glia组有Acox1和Acox2 mRNA的表达而无Acox3 mRNA的表达;C6组有Acox1和Acox3 mRNA的表达而无Acox2 mRNA的表达;且C6组Acox1 mRNA的相对表达量(2.777±0.342)明显高于Glia组(1.873±0.240,P <0.01)。6细胞中DBP和LBP mRNA相对表达量的变化Glia组和C6组均有DBP mRNA的表达而无LBP mRNA的表达;且两组间差别(0.919±0.128 vs 1.079±0.207)无统计学意义(P >0.05)。7细胞中THLA、THLB和SCPx mRNA相对表达量的变化Glia组有THLA和SCPx mRNA的表达而无THLB mRNA的表达;C6组有THLA和THLB mRNA的表达而无SCPx的表达;且THLA mRNA在两组间的差别(0.188±0.024 vs 0.187±0.031)无统计学意义(P >0.05)。8细胞中PPARαmRNA相对表达量的变化Glia组和C6组均有PPARαmRNA的表达;C6组PPARαmRNA的相对表达量(1.064±0.121)明显高于Glia组(0.463±0.091,P <0.01)。9细胞中LXRαmRNA相对表达量的变化Glia组和C6组均有LXRαmRNA的表达;且两组间的差别(0.734±0.147 vs 0.746±0.134)无统计学意义(P>0.05)。10细胞中HMGR mRNA相对表达量的变化Glia组和C6组均有HMGR mRNA的表达;C6组HMGR mRNA的相对表达量(2.324±0.100)明显高于Glia组(1.175±0.189,P <0.01)。11细胞中CYP46 mRNA相对表达量的变化Glia组有CYP46 mRNA的表达而胶质瘤细胞组(C6)无CYP46 mRNA的表达。12细胞中ABCA1和SR-BI mRNA相对表达量的变化Glia组和C6组均有ABCA1和SR-BI mRNA的表达;C6组SR-BI mRNA的相对表达量(1.778±0.214)明显高于Glia组(1.107±0.185,P <0.01);ABCA1 mRNA的表达在两组间的差别(1.397±0.270 vs 1.255±0.227)无统计学意义(p>0.05)。结论:1过氧化物酶体氧化不饱和直链VLCFA和支链VLCFA的酶基因在神经胶质细胞中表达。胶质细胞可能在大脑对VLCFA的解毒、激素的灭活以及胆固醇转出大脑方面发挥作用。2胶质瘤细胞中与胆固醇的合成、脂肪酸的氧化供能有关的基因表达增加,但CYP46基因及过氧化物酶体β-氧化途径中的Acox2、SCPx基因不表达。

全文目录


中文摘要  3-9
英文摘要  9-17
英文缩写  17-18
研究论文 神经胶质细胞和胶质瘤细胞中脂肪酸β-氧化和胆固醇代谢相关基因mRNA 的表达  18-55
  前言  18-21
  材料与方法  21-31
  结果  31-34
  附图  34-45
  附表  45-47
  讨论  47-50
  结论  50
  参考文献  50-55
综述 过氧化物酶体生物发生研究进展  55-65
致谢  65-66
个人简历  66

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中图分类: > 生物科学 > 遗传学 > 遗传学分支学科 > 细胞遗传学
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