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人类生精细胞凋亡相关新基因TSARG6与AR关系的初步研究

作　者: 李维娜
导　师: 卢光琇
学　校: 中南大学
专　业: 遗传学
关键词: Hsp40 雄激素受体少弱精症 DHPLC
分类号: Q343
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 65次
引　用: 2次
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内容摘要

在我国，不育不孕夫妇比例约为11.47％，男性不育又占其中的33.15％。在男子不育中特发性无精、少精症是数量较多、病情较重的一种，但病因一直不明确，要从根本上解决问题就必须了解精子发生的分子机制。精子发生和睾丸生殖细胞凋亡是一个多种调控因素参与的有序而复杂的过程，迄今为止，人们对精子发生的分子机制了解有限，因而研究特异性的睾丸生殖细胞凋亡基因的功能在理论上和实践上仍然十分重要。本实验室刘刚从人类睾丸cDNA文库中分离出人类生殖细胞凋亡新基因TSARG6和小鼠同源新基因mTSARG3。TSARG6蛋白含有DnaJ区和DnaJ_c区，属于热休克蛋白40家族新成员，在人类睾丸组织中特异表达。Hsp40在加强Hsp70与HOP复合体的结合方面起着关键作用。mTSARG3蛋白分别与Hsp90，Hsp70和AR蛋白存在结合关系。【目的】作为Ⅱ型Hsp40家族新成员的TSARG6在睾丸组织特异性表达，与精子发生和雄激素受体表达密切相关，但该基因的具体功能并不清楚。本研究将通过基因突变检测实验以及通过生物信息学预测来进一步证明TSARG6基因在精子发生中的具体途径。【方法】利用DHPLC结合限制性内切酶酶切和直接测序法。【结果】在TSARG6基因的第2外显子片断中发现5个多态位点(其中3个为已知多态位点rs10793069，rs10793068和rs625098，2个为新发现的多态位点)，1个同义突变，1个错义突变S36P。在TSARG6基因的第8外显子片断中，发现3个SNP，rs2306820，rs2306819和1个新的SNP位点。【结论】TSARG6作为HSP70的分子伴侣与人类精子发生有密切关系，TSARG6的氨基酸改变有可能通过影响雄激素与雄激素受体的结合导致雄激素不敏感综合征。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
目录  9-13
缩写词中英文对照简表  13-14
实验技术路线图  14-15
前言  15-17
第一章 TSARG6基因突变检测  17-41
  1.对象、材料与方法  17-23
    1.1 对象  17
    1.2 材料  17-18
      1.2.1 标本  17
      1.2.2 分子量标准  17
      1.2.3 主要试剂  17-18
      1.2.4 仪器设备  18
    1.3 方法  18-23
      1.3.1 外周血、脐血gDNA抽提  18-19
      1.3.2 PCR扩增  19-21
        1.3.2.1 引物  19-20
        1.3.2.2 PCR扩增体系及条件  20-21
      1.3.3 PCR产物检测  21
      1.3.4 限制性内切酶酶切结果检测  21-22
      1.3.5 DHPLC检测  22
      1.3.6 DNA测序  22
      1.3.7 限制性内切酶检测  22-23
  2 结果  23-35
    2.1 PCR扩增结果  23
    2.2 DHPLC结果  23
    2.3 测序结果  23-28
      2.3.1 TSARG6基因第2外显子测序结果  23-27
      2.3.2 TSARG6基因第8外显子测序结果  27-28
    2.4 利用DHPLC在正常人和少弱精患者中大量筛查TSARG6第2号外显子  28-29
    2.5 测序结果  29-30
    2.6 更改实验条件重新进行DHPLC检测  30-32
      2.6.1 重新设计引物TS2a和TS2b  30
      2.6.2 更改DHPLC检测条件  30-32
        2.6.2.1 更改DHPLC检测温度  30-31
        2.6.2.2 更改B液梯度  31
        2.6.2.3 将PCR产物变性  31-32
      2.6.3 重新设计引物TS2c  32
    2.7 限制性内切酶酶切  32-33
      2.7.1 分析TSARG6的第2外显子  32-33
      2.7.2 分析TSARG6的第8外显子  33
    2.8 限制性内切酶酶切结果  33-34
      2.8.1 限制性内切酶HpyF10VI酶切分析  33-34
      2.8.2 限制性内切酶TseI酶切分析  34
    2.9 A患者的TSARG6第2外显子错义突变T38C遗传自其父亲  34-35
  3 讨论  35-41
    3.2 变性高效液相色谱分析  36-38
    3.3 限制性内切酶酶切  38-41
第二章 TSARG6编码蛋白质和突变蛋白质的生物信息学分析  41-91
  1 方法  41-44
  2 结果  44-81
    2.1 蛋白质的物理化学性质分析  44-53
      2.1.1 酶切位点分析  45
      2.1.2 蛋白质在与特定蛋白酶或化学试剂作用下的内切产物  45-47
      2.1.3 蛋白质序列统计分析  47-53
    2.2 蛋白质的一级结构分析  53-58
      2.2.1 卷曲螺旋  53
      2.2.2 蛋白质基序分析  53-58
        2.2.2.1 蛋白质基序分析  53-55
        2.2.2.2 真核生物蛋白质功能位点的线形基序  55-58
    2.3 蛋白质的二级结构分析  58-64
      2.3.1 RCSB—PDB网站分析  58
      2.3.2 PredictProtein预测二级结构  58-64
    2.4 蛋白质的三级结构分析  64-69
      2.4.1 蛋白质的无序区域  64-65
      2.4.2 蛋白质的无序,有序和球形结构域  65
      2.4.3 蛋白质三级结构预测  65-69
    2.5 蛋白质拓扑学结构预测  69-73
      2.5.1 跨膜区分析  69-70
      2.5.2 亚细胞定位  70
      2.5.3 蛋白细胞内定位预测  70
      2.5.4 蛋白质的抗原决定簇预测  70-72
      2.5.5 蛋白质的活性位点预测  72-73
    2.6 蛋白质翻译后修饰预测  73-75
      2.6.1 豆蔻酰化位点和前导序列  73
      2.6.2 O—β—N一乙酰葡萄糖胺附着位点  73
      2.6.3 糖基磷脂酰肌醇修饰位点  73
      2.6.4 N—末端修饰情况  73
      2.6.5 ProtFun 2.2综合分析  73-75
    2.7 蛋白质功能方面分析  75-80
      2.7.1 蛋白质链上残基之间距离接触可能性分析  75-76
      2.7.2 蛋白质相互作用  76-77
      2.7.3 蛋白质功能预测  77-78
        2.7.3.1 protein function predictin  77-78
        2.7.3.2 Phyre  78
      2.7.4 组织特异性表达和氨基酸的位点阵表达  78-79
      2.7.5 蛋白质点突变的稳定性预测  79-80
    2.8 蛋白质生物磁共振数据分析  80-81
  3 讨论  81-91
    3.1 系统生物学  81
    3.2 TSARG6与HSP70  81-83
    3.3 TSARG6与雄激素受体  83-86
    3.4 生物信息学分析  86-89
    3.5 下一步工作  89-91
5 结论  91-92
6 参考文献  92-98
7 综述  98-110
8 致谢  110-111
9 个人简历  111

人类生精细胞凋亡相关新基因TSARG6与AR关系的初步研究

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