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乙型肝炎病毒相关性慢性肝病中雄激素受体的表达及多态性研究

作　者: 张俭省
导　师: 姜庆五
学　校: 复旦大学
专　业: 公共卫生
关键词: 雄激素受体乙型肝炎病毒肝细胞癌 X蛋白多态性
分类号: R512.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

据统计,在全世界的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者中,我国约占一半。对慢性乙型肝炎的基础研究和临床诊疗一直是我国重点。由于慢性乙型肝炎病毒感染引起的相关肝脏病变,特别是肝细胞癌(HCC)在临床上表现出明显的男性发病倾向,雄激素受体(AR)及其介导的信号通路的作用越来越引起人们的关注。HBV的某些因子与AR相互作用被认为是HBV相关HCC形成的一个重要机制。关于AR在正常肝组织和肝癌组织的表达目前还存在争议：早期对AR表达水平的研究多采用非直接的结合分析法,并非采用抗体直接检测,结果不够精准,而且不同的抗体其制备方法和质量也存在一定差异。更为重要的是,以往的研究多为小样本研究,对于HCC的病因或疾病背景也未加区分,HBV相关HCC中AR的表达还未见有较大病例数的文献报道。采用更为精确的定量方法,区分病因检测AR在HCC和肝脏中的表达成为必要。近年来陆续有研究表明,在体外HBx可通过影响蛋白小体的活性使AR的稳定性增加,从而提高细胞内AR蛋白的含量；对肝细胞系和HBx转基因鼠的研究表明,HBx蛋白可增强AR的转录活性,在与AR相关的致病与致癌过程中发挥了重要的作用。而在人体组织内,有关HBx蛋白和AR之间的关系目前还不明确。在结构上,AR基因第一外显子中含有两个三核苷酸重复序列,体外研究显示,CAG和GGC重复序列的长度和AR受体的表达及活性均密切相关。在对前列腺癌临床病例的研究中发现,CAG和GGC重复序列的长度与前列腺癌病人的发病风险、分级、进展和转移均有关。在对HCC的研究中也发现,CAG和GGC重复序列的长度与发病风险存在一定关系,但所见报道不多,其机制还不明确。目前,关于CAG和GGC重复序列在除HCC以外的其他HBV相关慢性肝病中的分布以及和肝脏病变之间的相关性还少有报道,CAG和GGC重复序列的多态性是否与慢性乙型肝炎患者的预后相关还不明确。本研究以HBV感染相关性慢性肝病(以慢性乙型肝炎和HBV相关HCC为主)为研究对象,通过对AR和HBx表达水平的研究,明确AR和HBx之间的相互关系,明确AR基因的多态性分布,以及和慢性乙型肝炎患者预后的关系。第一部分慢性乙型肝炎病毒感染的流行病学目的：明确慢性HBV感染和流行的特点,以及和HCC发生的关系。在明确HCC发病率在世界分布的同时,提出主要高危因素,明确本研究的目的和意义。方法：对近十年内有关HBV感染和HCC的流行病学、病因学和发病机制的文献进行归纳总结。结果：HBV在全球范围内感染率很高,尤其亚洲、非洲、南部欧洲和拉丁美洲是HBV感染的高发区和流行区,全世界慢性HBV感染的病例中有一半在中国。HBV感染与HCC的发生密切相关,特别是在HBV感染后发生肝硬化的病人,HCC的发生率可比正常人群高1000倍。HBV感染最严重的转归之一就是发生HCC,中国的HCC绝大多为HBV相关型,HCC病人的HBV标志物阳性率更高达90%左右。结论：临床上HBV相关慢性肝病表现出明显的性别差异,总体来说男性患者所占比率明显高于女性,男性更是HBV相关HCC发生中的一个重要独立风险因子。雄激素受体(AR)与HBV的某些因子相互作用可能在HBV相关HCC形成中发挥了重要作用,而HBx蛋白与AR的关系目前还未见有报道。在结构上AR基因第一外显子含有两个三核苷酸重复序列,关于CAG和GGC重复序列在除HCC以外的其他HBV相关慢性肝病中的分布以及和肝脏病变之间的相关性还少有报道,CAG和GGC重复序列的多态性是否与慢性乙型肝炎患者的预后相关还不明确。第二部分雄激素受体在乙型肝炎病毒相关性慢性肝病中的表达目的：以83例HBV相关HCC和189例慢性乙型肝炎肝穿刺标本作为研究对象,通过对AR蛋白水平和mRNA水平的检测,明确AR在HBV相关性慢性肝病中的表达,以及和HCC患者及慢性乙型肝炎病人临床病理学指标的联系；并通过设立HBV阴性的对照组,探讨AR在HBV相关致病和致癌中的作用。方法：选取复旦大学附属中山医院肝肿瘤外科2007-2008年间83例HBV相关HCC部分肝切除新鲜标本作为研究对象、14例HBV阴性的HCC患者部分肝切除新鲜标本作为对照、13例肝血管瘤患者的瘤旁新鲜肝组织作为良性对照；同时选取复旦大学上海医学院病理学系存档的1988-2002年间189例慢性乙型肝炎肝穿刺活检病例作为研究对象、75例病理诊断为“无病理诊断性异常”的肝穿刺病例作为阴性对照。荧光定量real-time RT PCR检测AR和HBx在mRNA水平的表达；Western blot检测AR和HBx蛋白表达的定量;免疫组化染色En Vision二步法检测AR和HBx蛋白的组织内表达。结果：在mRNA水平,HBV相关HCC癌旁组织(P=0.000)和癌组织(P=0.000)中,AR和HBx表达的相关性具有非常显著性意义；AR(P=0.011)和HBx(P=0.000)在癌旁组织中的表达均明显高于癌组织的表达；AR在HBV相关HCC癌旁组织(P=0.027)和癌组织(P=0.021)中的表达明显高于HBV阴性HCC。Western blot检测显示,HBV相关HCC癌旁组织(P=0.008)和癌组织(P=0.012)中AR和HBx的表达呈显著正相关；AR在癌旁组织中的表达明显高于癌组织(P=0.018)；癌旁组织中,AR蛋白在HBV相关HCC的表达明显高于HBV阴性HCC(P=0.029)和良性对照(P=0.029)。免疫组织化学染色显示,HBV相关HCC癌旁组织中,AR和HBx的表达呈正相关(P=0.049)；AR在癌旁组织中的表达明显高于癌组织(P=0.038)；癌旁组织中,AR蛋白在HBV相关HCC的表达明显高于HBV阴性HCC(P=0.021)和良性对照(P=0.043)；肝穿组织中,HBV感染改变了肝脏中AR表达的生理变化。AR在HBV相关HCC癌旁组织中的表达,无论是mRNA水平(P=0.046)还是蛋白水平(P=0.049),都与肝细胞癌的分化程度相关；慢性乙型肝炎患者中,AR的表达和Scheuer评分反应炎症损伤程度的G分级呈负相关(P=0.034)。结论：明确了AR在HBV相关HCC和慢性乙型肝炎肝组织内的表达,结果提示AR在HCC的发生和发展中起了一定作用,HBx诱导AR的表达可能是HBV介导HCC形成中的一种机制。癌旁组织AR的表达高于癌组织,提示雄激素受体治疗在肿瘤形成后可能无效。在慢性乙型肝炎中,AR介导的信号通路可能与炎症反应有关。第三部分雄激素受体CAG和GGC重复序列的多态性和慢性乙型肝炎患者预后的关系目的：明确AR的表达和第一外显子CAG和GGC重复序列的多态性在HBV相关HCC和慢性HBV相关性肝病中的分布；并通过对慢性乙型肝炎患者的预后随访和对肝穿刺标本的回顾性研究,明确AR多态性对慢性乙型肝炎患者临床病理学指标及预后的影响。方法：对145例成人慢性乙型肝炎患者进行预后随访,并按有无肝硬化的发生以及血清谷丙转氨酶(ALT)水平将患者分为ALT正常组和ALT波动组、肝硬化组和非硬化组,并与第一部分83例HBV相关HCC病例作比较,53例“无病理诊断”性异常的成人肝穿病例为阴性对照。从福尔马林固定、石蜡包埋的肝穿刺组织中提取基因组DNA,用荧光标记引物PCR扩增含CAG和GGC重复序列的片段,通过基因扫描检测扩增片段的长度,计算重复序列的个数。结果：HBV相关HCC中,CAG和GGC重复序列的个数在癌组织中出现突变；CAG重复序列的长度与患者血清学中HBeAg(P=0.003)和HBeAb(P=0.032)的阳性与否有关；感染HBV基因型C型的患者中CAG的长度高于感染B型的患者(P=0.041)。CAG和GGC重复序列的个数在血清ALT正常组和ALT波动组、肝硬化组和非肝硬化组之间未见显著性差异；男性患者的CAG和GGC重复序列的长度在慢性乙型肝炎、HBV相关HCC和阴性对照组之间均未见显著性差异；在女性患者中,慢性乙型肝炎组CAG重复序列的个数明显小于HBV相关HCC(P=0.037)。CAG重复序列个数若以19个为分界点,HBV相关HCC女性患者中CAG大于19的比率明显高于慢性乙型肝炎女性患者(x2=5.71,p=0.018)。结论：HBV相关HCC患者中,CAG越长,则HBeAg的阳性率越高,HBeAb的阳性率越低；CAG和GGC重复序列的个数与患者的血清ALT水平和肝硬化的发生无关；男性患者的CAG和GGC重复序列多态性和慢性乙型肝炎和HBV相关HCC的发生无关；慢性乙型肝炎女性患者中CAG重复序列长的有更高的HCC发病风险,两条CAG重复序列个数平均值大于19个时,将增加患者者发生HBV相关HCC的风险。

全文目录

中文摘要  5-9
英文摘要  9-14
第一部分第一部分慢性乙型肝炎病毒感染的流行病学  14-27
  一、乙型肝炎病毒的结构和感染特点  14-15
  二、慢性HBv感染的流行病学  15-16
  三、HBV相关性肝细胞癌的流行病学  16-18
  四、HBv相关性肝细胞癌的危险因子  18-21
  小结  21-22
  参考文献  22-27
第二部分雄激素受体在乙型肝炎病毒相关性慢性肝病中的表达  27-52
  前言  27-28
  材料与方法  28-37
  结果  37-45
  讨论  45-48
  小结  48
  参考文献  48-52
第三部分雄激素受体CAG和GGC重复序列的多态性和慢性乙型肝炎患者预后的关系  52-67
  前言  52
  材料与方法  52-55
  结果  55-63
  讨论  63-64
  小结  64-65
  参考文献  65-67
附录:在读期间发表论文  67-68
致谢  68-69

乙型肝炎病毒相关性慢性肝病中雄激素受体的表达及多态性研究

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