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短小芽孢杆菌生物合成D-核糖及代谢通量分析的研究

作　者: 于志萍
导　师: 王昌禄
学　校: 天津科技大学
专　业: 食品科学
关键词: D-核糖短小芽孢杆菌代谢通量分析
分类号: TS201
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

本文对短小芽孢杆菌转酮酶缺失突变株(Bacillus pumilus SY-6)的生理生化特性及培养基配方、溶解氧浓度等发酵条件对B．pumilus SY-6生物合成D-核糖的影响进行了较为详细的研究，构建了对该突变株进行代谢通量分析的平台，并利用此平台对不同发酵条件下B．pumilus SY-6的代谢网络进行了分析，对D-核糖提取精制的条件也进行了较为细致的探讨。考察了无机氮源对B．pumilus SY-6菌体生长和D-核糖发酵的影响，结果表明该突变株不能以无机氮源为唯一氮源进行D-核糖发酵。以玉米粉糖化液为底物进行D-核糖发酵，考察了玉米粉不同酶解方式和不同初糖浓度对发酵的影响，在以玉米粉双酶酶解液为底物进行摇瓶发酵时最高产量达到63.4g／L。应用响应面分析法(RSA，Response Surface Analysis)，设计了葡萄糖、玉米浆、硫酸铵三因素三水平的实验方案，对发酵培养基进行了优化，并确定了B.pumilus SY-6生长和发酵最佳C／N比。结果表明，6#和15#培养基配方分别在D-核糖产量和转化率上优于其它培养基配方，摇瓶发酵结束后D-核糖产量分别为80g／L和71g／L，转化率分别为33.3％和37.9％，对照实验中D-核糖产量和转化率为58g／L和32.2％。同时还确定了该突变株生长和发酵最佳C／N比分别为19：1和11：1。在5L发酵罐中对不同溶解氧浓度下D-核糖发酵的过程参数进行了分析，探讨了溶解氧浓度影响D-核糖发酵的机理，提出了在D-核糖发酵过程中0至10h控制溶解氧浓度为60％，10h至发酵结束控制溶解氧浓度为80％的分阶段供氧的控制模式。本文在分析了胞内EMP途径、HMP途径、TCA循环和生物大分子合成途径之后，基于化学计量平衡方程，构建了B．pumilus SY-6菌株生物合成D-核糖的代谢网络。应用代谢通量分析法，得到了不同培养基配方和不同溶解氧浓度下B．pumilus SY-6的胞内代谢通量分布，对G-6P、R-5P、PEP三个关键节点进行了节点分析。本文确定了D-核糖发酵液预处理、脱色、脱盐、浓缩等工序的具体参数，D-核糖总提取收率达到79％。

全文目录

1 、前言  7-22
  1.1 D-核糖的理化性质  7
  1.2 D-核糖的生产方法  7-12
    1.2.1 D-核糖生产菌株的选育  9-11
    1.2.2 转酮酶缺失突变株的基因多效性  11-12
  1.3 D-核糖的应用  12-14
    1.3.1 D-核糖在食品工业中的应用  13
    1.3.2 D-核糖在生化工程中的应用  13
    1.3.3 D-核糖在医药工业中的应用  13-14
  1.4 D-核糖的检测  14
  1.5 国内外D-核糖生产现状及应用  14-15
  1.6 生物合成D-核糖存在的主要问题  15-16
  1.7 代谢工程简介  16-17
  1.8 代谢通量分析  17-21
    1.8.1 代谢通量分析简介  17-19
    1.8.2 代谢通量分析理论  19-20
    1.8.3 代谢通量分析的应用进展  20-21
  1.9 论文的主要研究内容  21-22
2 、材料与方法  22-31
  2.1 材料  22-24
    2.1.1 菌种  22
    2.1.2 主要培养基  22
    2.1.3 主要实验材料  22-23
    2.1.4 主要仪器设备  23
    2.1.5 主要溶液  23-24
  2.2 实验方法  24-30
    2.2.1 分析方法  24-26
    2.2.2 菌学特性  26-27
    2.2.3 D-核糖发酵工艺  27-29
    2.2.4 D-核糖提取精制  29-30
  2.3 数学计算  30-31
3 、结果与讨论  31-59
  3.1 菌种鉴定  31-33
    3.1.1 生理生化试验及转酮酶缺失突变株的鉴定  31
    3.1.2 B.pumilus SY-6生长曲线的绘制及菌体形态  31-33
  3.2 无机氮源对D-核糖合成的影响  33-35
    3.2.1 无机氮源对B.pumilusSY-6生长的影响  33-34
    3.2.2 无机氮源对D-核糖发酵的影响  34-35
  3.3 山梨醇对D-核糖发酵的影响  35-36
  3.4 培养基C／N比对D-核糖发酵的影响  36
  3.5 应用响应面分析法优化培养基配方及确定培养基最佳C／N比  36-40
    3.5.1 应用响应面分析法优化培养基配方  37-38
    3.5.2 B.pumilus SY-6最适生长和最适发酵C／N比的确定  38-40
  3.6 以玉米粉为底物对D-核糖发酵的影响  40-41
    3.6.1 玉米粉不同酶解方式对D-核糖发酵的影响  40
    3.6.2 不同浓度玉米粉酶解液对D-核糖发酵的影响  40-41
  3.7 溶解氧浓度(DOT)对D-核糖发酵的影响  41-45
    3.7.1 临界溶解氧浓度的测定  41-42
    3.7.2 不同溶解氧浓度下B.pumilus SY-6生物合成D-核糖的动力学特征  42-43
    3.7.3 氧代谢途径及溶解氧浓度影响D-核糖发酵的机理  43-45
    3.7.4 分阶段控制溶解氧浓度进行D-核糖发酵的提出及验证  45
  3.8 代谢网络模型的建立及B.pumilus SY-6合成D-核糖的代谢通量分析  45-53
    3.8.1 B.pumilus SY-6代谢网络的建立  45-47
    3.8.2 分批发酵不同发酵阶段代谢网络模型  47-50
    3.8.3 不同溶解氧浓度及不同培养基配方下代谢网络模型及通量分析  50-51
    3.8.4 代谢网络中节点分析  51-53
    3.8.5 应用代谢通量分析方法造成误差的可能原因  53
  3.9 D-核糖的提取精制  53-59
    3.9.1 发酵液预处理、脱色、脱盐  53-57
    3.9.2 D-核糖的浓缩  57-59
4 、附录  59-61
5 、结论  61-63
6 、展望  63-64
7 、主要参考文献  64-68
8 、致谢  68-69
9 、研究生阶段发表论文情况  69

短小芽孢杆菌生物合成D-核糖及代谢通量分析的研究

内容摘要

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