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灵芝深层发酵生产生物活性物质的研究

作　者: 余素萍
导　师: 潘迎捷；张劲松
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 灵芝深层发酵多糖三萜子实体 HPLC图谱
分类号: S567.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

灵芝多糖和灵芝三萜是灵芝(Ganoderma)的主要生物活性成分。获得灵芝生物活性成分的途径有两种，一种是从子实体中提取，一种是从发酵产物中获取。子实体质量不稳定易受栽培环境影响，而且栽培周期长，一般需要2～3个月的时间，通过发酵获取的目标产物，可通过发酵条件的控制来保证质量稳定且生产周期短。本研究从22个国内主要栽培灵芝菌株中筛选出了胞内多糖产量高的菌株G21和G7，胞内三萜产量高的菌株GL31，并以胞内多糖或胞内三萜为目标产物进行了发酵工艺的优化，并研究了各种发酵产物的代谢规律。本论文首次通过HPLC分析和体外抗肿瘤细胞模型结合，研究了不同培养方式和不同发酵阶段菌丝三萜的变化与抗体外肿瘤细胞的相关性，并优化了生产有效抑制体外肿瘤细胞三萜组分的培养方式与培养时间；并研究了用于制备灵芝发酵菌种的有效方法。首次采用比色法，HPLC图谱及体外细胞模型实验比较了最优发酵条件下发酵的菌丝体与对应菌株的子实体的活性成分含量、组分差异和体外细胞的活性，提出在灵芝药用资源开发中菌丝体替代子实体的依据。在高产菌株的筛选中发现，在本实验条件下无法获得胞内多糖产量、胞内三萜产量及胞外多糖产量同时很高的菌株，且菌株菌丝平板生长速度与液体培养菌丝生物量无直接相关性。高产菌株G21、G7在优化(单因子，正交实验)的发酵条件下最高胞内多糖产量分别为0.288g/100ml，0.533g/100ml，GL31胞内总三萜最高产量为41.5mg/100ml，而在最适摇床培养时间时胞内总三萜的产量为35.1mg/100ml。摇床培养一段时间后进行静置培养的方式有利于菌株GL31胞内总三萜含量及产量的提高，胞内总三萜最高产量为49.1mg/100ml。G21于3L发酵罐中最优发酵条件是温度为28℃，转速为180rpm，通气量为1.5v/v/m，其它发酵条件同摇瓶，胞内多糖产量2.43g/L，生物量为18g/L。本研究通过高产菌株的代谢曲线研究发现胞内多糖是初级代谢产物，胞内三萜是次级代谢产物，而以胞外多糖为目标产物时，发酵后期才可收获，前期的胞外多糖主要为培养基本身的多糖；胞外三萜总产量很低只有胞内三萜总产量的三分之一左右，因此以胞内多糖与胞内三萜为目标产物进行发酵研究比以胞外多糖、胞外三萜为目标灵芝深层发酵生产生物活性物质的研究产物进行发酵研究更具有工业化生产意义;不同的菌株发酵过程中pH变化趋势不同，但pH4.o可作为部分目标产物的发酵终点指示。另外在本实验条件下很难获得各种代谢产物同时高产的菌株的原因是各种发酵产物主要合成的时期不同。不同发酵阶段的灵芝菌丝体中三菇类成分与抑制体外肿瘤细胞生长的相关性研究表明，不同生长阶段菌丝中的三菇在组分、相对含量及各组分间的比例都有所变化，有6个组分峰的增高与抗肿瘤作用呈正相关，有2个组分峰的增高与抗肿瘤作用呈负相关。本研究确定了生产有效抗肿瘤三菇组分最佳培养方式是摇床培养，最佳培养时间是132小时。本研究首次提出连续液体传代培养有利于获得完全利用培养基基质的菌种形态，提高菌种活性，是制备灵芝发酵菌种有效方法。此研究揭示了灵芝通过倒种法发酵有利于提高生物量，本研究中菌株G21传代到第6代时生物量达3.504留loonil，高于已有报道。同时还提出可通过终胞外液体积与初始培养液体积的比值来指示生物量的高低。 GL31菌丝三菇的含量及对肿瘤细胞K562的抑制作用均高于该菌株三个地点栽培的子实体三菇，因此对三菇指标而言用发酵菌丝体来替代子实体是可行的。G21胞内多糖含量高于该菌株三个地点栽培子实体的多糖含量，且在一定的发酵条件下菌丝多糖与该菌株的子实体多糖对巨噬细胞的激活作用相当。因此对多糖指标而言用发酵菌丝体来替代子实体是可行的。

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-13
文献综述  13-30
  一、灵芝的分类地位  13
  二、灵芝的药用价值  13
  三、灵芝的活性成分  13-19
    (一) 、灵芝多糖  13-17
      1 、灵芝多糖的提取、分离、纯化及结构研究  13-16
      2 、灵芝多糖的药理研究  16-17
    (二) 、灵芝三萜类化合物  17-19
      1 、灵芝三萜的提取、分离、纯化及结构特点  17-18
      2 、灵芝三萜的药理活性  18-19
  四、我国野生灵芝的分布及种质资源的研究现状  19-20
  五、灵芝深层发酵生产生物活性物质的研究现状  20-24
    (一) 、营养因子对灵芝深层发酵生产目标产物的影响  21-22
    (二) 、非营养因子对灵芝深层发酵生产目标产物的影响  22-24
  六、中药指纹图谱的研究现状及指纹图谱技术在灵芝深层发酵研究中的应用  24-28
  七、本研究的目的与意义  28-30
名词缩写  30-31
材料与方法  31-42
  材料  31-33
    一、菌株  31
    二、细胞株  31
    三、动物  31
    四、培养基  31-32
    五、试剂  32-33
  方法  33-42
    一、高产菌株的筛选  33-34
      1 、胞内多糖高产菌株的筛选  33-34
      2 、胞内三萜高产菌株的筛选  34
      3 、胞外多糖产量的比较  34
      4 、菌丝生长速度的比较  34
    二、培养基的优化  34-35
      1 、营养因子的单因子筛选实验  35
      2 、营养因子的正交实验  35
    三、非营养因子的优化  35-37
    四、胞内多糖高产菌株发酵罐条件的优化  37
    五、胞内多糖高产菌株放大培养实验  37
    六、胞内多糖高产菌株连续10代液体传代实验  37-38
    七、三萜提取方法的选择  38-39
      1 、子实体三萜提取方法的选择  38
      2 、菌丝体三萜提取方法的比较  38-39
    八、不同发酵阶段三萜高压液相图谱的比较  39
    九、不同发酵阶段菌丝三萜对肿瘤细胞K562的抑制作用  39
    十、不同发酵阶段胞内多糖对小鼠巨噬细胞的激活作用  39-40
    十一、胞内三萜高产菌株发酵产物与栽培子实体的比较  40-41
    十二、胞内多糖高产菌株发酵产物与栽培子实体的比较  41-42
结果与分析  42-71
  一、高产菌株的筛选  42-44
    1 、胞内多糖高产菌株的筛选  42
    2 、胞内三萜高产菌株的筛选  42-43
    3 、胞外多糖产量的比较  43-44
    4 、菌丝生长速度的比较  44
  二、培养基的优化  44-52
    1 、营养因子的单因子筛选  45
    2 、营养因子的正交实验  45-52
  三、非营养因子的优化(摇瓶培养)  52-58
    1 、高产菌株最适初始pH的筛选  52-53
    2 、高产菌株最适装液量的筛选  53-54
    3 、高产菌株最适接种量的筛选  54-55
    4 、高产菌株最适培养时间的筛选及各种代谢产物的代谢规律  55-58
  四、胞内多糖高产菌株G21发酵罐条件的优化  58-59
    1 、发酵温度的优化  58
    2 、转速与通风量的优化  58
    3 、发酵代谢曲线  58
    4 、稳定性实验  58-59
  五、胞内多糖高产菌株G21放大培养实验  59-60
  六、胞内多糖高产菌株G21连续10代液体传代实验  60-61
  七、三萜提取方法的选择  61-63
    1 、子实体三萜提取方法的选择  61-63
    2 、菌丝三萜提取方法的比较  63
  八、不同发酵阶段三萜高压液相图谱的比较研究  63-66
    1 、摇床培养菌丝三萜成分的HPLC分析  63-64
    2 、先摇床培养84小时后静置培养菌丝三萜成分的HPLC分析  64-65
    3 、不同培养方式产生菌丝三萜HPLC图谱比较  65
    4 、摇床培养胞外液三萜成分的HPLC分析  65-66
  九、不同发酵阶段菌丝三萜对肿瘤细胞K562的抑制作用  66-67
    1 、不同浓度的菌丝三萜对肿瘤细胞K562的抑制作用  66
    2 、摇床培养菌丝三萜对肿瘤细胞K562的抑制作用  66
    3 、先摇床培养后静置培养菌丝三萜对肿瘤细胞K562的抑制作用  66-67
    4 、不同培养方式菌丝三萜对肿瘤细胞K562抑制作用的比较  67
  十、不同发酵阶段胞内多糖对小鼠巨噬细胞的激活作用  67-68
    1 、胞内多糖不同组分对小鼠巨噬细胞的影响  67-68
    2 、不同发酵阶段的胞内多糖对小鼠巨噬细胞的激活作用  68
  十一、 G21发酵菌丝与栽培子实体的比较  68-69
    1 、多糖含量的比较  69
    2 、多糖对巨噬细胞激活作用的比较  69
  十二、 GL31发酵菌丝与栽培子实体的比较  69-71
    1 、总三萜含量的比较  69
    2 、 HPLC图谱的比较  69-70
    3 、三萜对肿瘤细胞K562抑制作用的比较  70-71
讨论  71-75
  一、高产多糖和三萜灵芝菌株的筛选  71
  二、高产多糖和三萜灵芝菌株发酵条件的优化  71-72
  三、 G21放大培养实验  72
  四、 G21连续10代液体传代实验  72-73
  五、不同发酵阶段胞内三萜与抗种瘤作用的相关性  73-74
  六、胞内三萜高产菌株GL31发酵菌丝与对应菌株子实体的比较  74-75
结论  75-76
参考文献  76-82
附录  82-84
致谢  84

灵芝深层发酵生产生物活性物质的研究

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