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重组蛇毒锯鳞蝰素（Echistatin）原核高效表达体系的构建

作　者: 韩兵社
导　师: 牛勃；章汴生
学　校: 山西医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 蛇毒锯鳞蝰素融合表达包涵体 DNA合成
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

目的构建蛇毒锯鳞蝰素（Echistatin）的原核高效表达体系方法由Genebank数据库检索蛇毒锯鳞蝰素（Echistatin）的氨基酸序列，结合大肠杆菌蛋白质合成体系对氨基酸密码子使用的偏爱性，设计了Echistatin编码基因，体外人工合成编码基因DNA片段，通过适当的限制性内切酶位点插入表达载体pBV220，分别构建了Echistatin的单拷贝表达克隆、双拷贝串联表达克隆；进一步通过PCR技术构建Echistatin的融合表达基因克隆。由限制性内切酶酶切实验、DNA序列测定鉴定重组表达质粒的正确性。将上述重组表达质粒CaCl₂法转化大肠杆菌JM109、DH5α、BL21（DE3）、BL21（DE3）plySs感受态细胞，温控诱导目的蛋白表达。SDS-PAGE及凝胶电泳分析系统检测目的蛋白的分子量、表达亘，Western—blotting检测目的蛋白的抗原抗体反应特异性。采用超声结合溶菌酶的方法裂解大肠杆菌，检测目的蛋白的表达形式，纯化融合蛋白，血小板聚集实验测定其生物学活性。结果设计并合成了Echistatin编码基因DNA序列，构建了Echistatin单拷贝表达载体，经DNA测序鉴定正确后，SDS-PAGE及Western-blotting结果表明：Echistatin在上述菌株中未获得高效表达。设计并合成了Echistatin编码基因的改进DNA序列，构建了Echistatin改进序列利原有序列的串联表达载体，经DNA测序鉴定正确后，SDS-PAGE山西医科大学2002届硕士学位论文及western一blotting结果表明:Echistatin在上述菌株中未获得高效表达。构建了Echistatin融合蛋白表达载体，经DNA测序鉴定正确后，温控诱导表达，获得了高效表达，表达产物经505一队GE分析，分子量为16000Oa，符合预计的融合蛋白分子量，表达产物.ll’菌体总蛋白的30%以上，westem一blotting结果显示，该日的蛋白能够和Echistatin多克隆抗体发生特异性抗原抗体反应，表明我们成功构建了 Eohistatin的高效融合表达克隆。该融合蛋自含有载体蛋自hPKS，His x6纯化标记，Met澳化佩裂解位点，经裂解可获得不含Met的重组Echistatin。超声破菌证明:表达产物土要以不溶的包涵体形式存在。结论成功构建了Echistatin的原核高效表达克隆，表达量高于现有国内外研究水平，为Echistatin功能及相关疾病的研究奠定了基础。小分子量异源蛋自在人肠杆菌的表达受mRNA不稳定、翻译起始效率低、易被蛋自酶降解等因素的干扰，较难获得高效表达，通过与已高表达的蛋自融合表达可以克服以上问题，可以使大多数蛋白获得高效表达。配合使用不同的载体蛋自和纯化、标记序列，可大人简化后续的鉴定、纯化!一艺，是一种简便、快速的真核蛋自原核表达策略。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-7
前言  7-9
一 Echistatin基因序列的设计及合成  9-15
二 Echistatin原核表达体系的构建-单拷贝表达  15-28
三 Echistatin原核表达体系的构建-双拷贝串联表达  28-35
四 Echistatin原核高效表达体系的构建-融合蛋白表达  35-45
五小结  45-46
参考文献  46-48
综述及其参考文献  48-58
附: 已发表论文及获奖情况  58-62
致谢  62

重组蛇毒锯鳞蝰素（Echistatin）原核高效表达体系的构建

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