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福眼龙眼（Dimocarpus longan Lour.cv.Fuyan）POD 的分离纯化与若干采后生理的初步研究

作　者: 林琳
导　师: 潘东明
学　校: 福建农林大学
专　业: 果树学
关键词: 龙眼过氧化物酶分离纯化同工酶多酚氧化酶采后生理
分类号: S667.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）是影响龙眼果实采后果皮褐变的关键酶。本研究以福眼龙眼为材料，经过提取、饱和度为30％～80％的硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-25柱层析脱盐、DEAE-Cellulose离子交换柱层析、HA柱层析和Sephacryl S-200 HR柱分子筛色谱等步骤，首次对成熟期果实果皮中的过氧化物酶进行了纯化研究。 5％～20％的线性水平板梯度胶半干电泳的试验结果表明，纯化得到的蛋白质中包含4个组分，其分子量分别为290.1KD、232.1KD、188.5KD和170.7KD；经与POD同工酶染色结果对照，显示所获得的4个组分的蛋白质为4个不同分子大小的POD酶。SDS-PAGE结果显示，纯化得到的这4个过氧化物酶中，包含一个分子量为56.4KD的最基本的亚基；分子量分别为290.1KD、232.1KD和170.7KD的3个POD酶分别是由该单一亚基组装形成的5聚体、4聚体和3聚体，分子量为188.5KD的POD酶可能是异型多体蛋白。果皮中的过氧化物酶（POD）与多酚氧化酶（PPO）同工酶电泳显示，这两种酶的酶谱条带的迁移率表现一致。经过DEAE-Cellulose离子交换柱层析分离后，POD被分成2个部分，以最终纯化得到的这4个组分为前一个部分，在总POD活性中占绝对优势；后一个组分活性很小。对纯化得到的POD酶的生化特性进行了初步研究，发现其对愈创木酚反应的最适pH值为7.0，对4-甲基邻苯二酚和邻苯二酚的最适反应pH值分别为8.5和9.0；同时，纯化得到的POD亦表现出PPO活性。其对底物邻苯二酚和4-甲基邻苯二酚表现出不同的催化氧化反应特性。对于4-甲基邻苯二酚的活性在pH6.0～pH8.0范围内呈上升趋势。综合研究结果表明，从龙眼果皮POD和PPO的同工酶谱一致；分离纯化的POD也具有PPO活性；在H₂O₂存在的情况下，POD对于酚类物质具有氧化能力，不仅能氧化一元酚，还能氧化二元酚。因此可以认为，福眼龙眼果皮中的POD和PPO应是同一蛋白质。文中还对POD、PPO与果实采后衰老和褐变进行了讨论。本试验还对福眼龙眼果实采后衰老和褐变过程中的生理生化变化进行了初步研究。

全文目录

目录  4-7
缩略词对照表  7-8
摘要(中文)  8-9
Abstract(English)  9-10
第一章文献综述  10-27
  1 过氧化物酶(POD)及其与果实采后衰老褐变的研究  10-14
    1.1 过氧化物酶(POD)生化性质研究  10-12
    1.2 过氧化物酶的组织化学定位  12
    1.3 过氧化物酶的生理作用  12-14
  2 多酚氧化酶(PPO)及其与果实采后衰老褐变的研究  14-19
    2.1 多酚氧化酶的生化性质研究  14-15
    2.2 多酚氧化酶的组织化学定位  15-16
    2.3 多酚氧化酶的生理作用  16-19
      2.3.1 多酚氧化酶与植物光系统之间的关系  16-17
      2.3.2 多酚氧化酶在酚类代谢中的作用  17-18
      2.3.3 多酚氧化酶在果实采后成熟衰老的关系  18-19
  3 多酚氧化酶和过氧化物酶的关系  19-20
  4 龙眼采后生理研究及保鲜技术现状  20-27
    4.1 龙眼采后的生理研究现状  21-25
    4.2 龙眼采后保鲜贮运技术  25-27
第二章龙眼果皮POD的分离纯化研究  27-48
  1 材料与处理  27
  2 POD的提取、分离与纯化方法  27-30
    2.1 酶的提取、(NH_4)_2SO_4盐析分级与Sephadex G-25柱脱盐  27
    2.2 POD的DEAE-Cellulose柱层析分离  27-28
    2.3 POD的HA柱层析分离  28
    2.4 POD的Sephacryl S-200 HR柱层析分离  28
    2.5 POD活性检测方法  28
    2.6 多酚氧化酶(PPO)活性测定  28-29
    2.7 酶电泳检测方法  29
    2.8 SDS-PAGE  29
    2.9 不同底物对POD活性的影响  29
    2.10 不同pH值对POD活性的影响  29
    2.11 不同底物对POD的PPO活性的影响  29-30
    2.12 不同pH值对POD的PPO活性的影响  30
  3 结果与分析  30-48
    3.1 龙眼采后果皮POD和PPO同工酶谱的变化  30-32
    3.2 POD的分离纯化研究  32-48
      3.2.1 POD的DEAE-Cellulose柱层析分离  32-34
      3.2.2 POD的HA柱层析分离  34-35
      3.2.3 POD的Sephacryl S-200 HR柱层析分离  35-39
      3.2.4 不同底物对POD活性的影响  39-43
      3.2.5 POD活性的光谱学特性  43-44
      3.2.6 不同底物对POD的PPO活性的影响  44-46
      3.2.7 不同pH值对POD的PPO活性的影响  46-47
      3.2.8 POD的PPO活性之光谱学特性  47-48
第三章龙眼若干采后生理的初步研究  48-58
  1 材料与处理  48
  2 试验方法  48-51
    2.1 呼吸强度的测定  48
    2.2 PPO、POD、SOD的提取与活性测定  48-50
      2.2.1 多酚氧化酶(PPO)活性测定  49
      2.2.2 过氧化物酶(POD)活性测定  49
      2.2.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定  49-50
    2.3 酚类物质含量的测定  50
      2.3.1 水溶性酚类、非水溶性酚类物质测定  50
    2.4 木质素的测定  50
    2.5 类黄酮和花色素苷含量测定  50-51
  3 结果与分析  51-58
    3.1 采后果实呼吸强度的变化  51
    3.2 采后果实果皮PPO、POD、SOD活性的变化  51-58
      3.2.1 PPO的活性变化  52
      3.2.2 POD的活性变化  52-53
      3.2.3 SOD的活性变化  53
      3.2.4 酚类物质含量变化  53-55
      3.2.5 木质素含量的变化  55-56
      3.2.6 类黄酮和花色素苷含量的变化  56-58
第四章讨论与小结  58-66
  4.1 POD的分离行为  58
  4.2 POD的亚基构成  58-59
  4.3 不同底物及不同pH值对POD活性的影响  59
  4.4 不同底物对POD的PPO活性的影响  59-60
  4.5 不同pH值对POD的PPO活性的影响  60
  4.6 福眼果皮PPO和POD、SOD与成熟衰老的关系  60-61
  4.7 福眼果皮POD与PPO的关系  61-63
  4.8 呼吸强度与果实成熟衰老  63
  4.9 酚类物质含量变化、木质素含量变化与果实成熟衰老  63
  4.10 花青苷、类黄酮、总酚含量与果实成熟衰老  63-64
  4.11 小结  64-66
参考文献  66-77
致谢  77

福眼龙眼（Dimocarpus longan Lour.cv.Fuyan）POD 的分离纯化与若干采后生理的初步研究

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