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紫外线对HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达的影响

作　者: 姜红
导　师: 何春涤
学　校: 中国医科大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 紫外线 HaCaT细胞结合珠蛋白 RT-PCR
分类号: R751
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

前言结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)是分布于人及其他哺乳动物体液中具有结合血红蛋白能力的一种α-唾液酸糖蛋白，主要由肝脏合成，也可在脂肪细胞、皮肤、脾、肌肉、肺内等合成。除与游离血红蛋白结合外，Hp还是急性期蛋白之一，在抗感染、抗炎症、损伤组织修复、抗氧化及维持内环境稳定的过程中发挥重要作用。Xie等发现：Hp可以抑制培养状态下表皮内朗格汉斯细胞(Langerhans cell，LCs)转变为抗原递呈细胞，将含有LCs的表皮置于无血清的培养基中，几天后，LCs内的Hp迅速减少。我科用原位杂交技术证实：角质形成细胞等上皮采源的细胞是正常人皮肤组织中表达Hp mRNA的主要细胞，同时在HaCaT细胞中也发现有Hp mRNA及蛋白质表达。然而影响Hp mRNA及蛋白质表达的因素及其在表皮中的作用尚不清楚。本研究通过HaCaT细胞紫外线UVA、UVB照射后Hp mRNA表达情况的半定量分析，初步探讨紫外线对Hp mRNA表达的影响。材料与方法一、实验材料 1．HaCaT细胞；肝HepG2细胞； 2．引物：内对照PER引物：扩增磷酸丙糖脱氢酶(GAPDH)特异性引物，上游：5′-TCGCCAGCCGAGCCACAT-3′，下游：5′-GGAACATGTAAACCATGTAGTTG-3′，产物172bp；结合珠蛋白(Hp)PCR引物，上游：5′-CTGTGCTGGCATGTCTAAG-3′，下游5′-CAGCTATGATCTTCTGAAC-3′，产物197bp； 3．主要试剂及物品：Trizol；反转录试剂盒；PCR试剂盒； 4.主要仪器:COZ培养箱;PCR扩增仪;SS一03紫外线光疗仪。二、实验方法 1.UvA 12J/cmZ、uvB 30mJ/c扩分别照射”区CaT细胞。照射后20分钟、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时收获细胞(每24小时换新鲜培养液)。 2.提取RNA:基本按照予‘旧1试剂盒说明操作;紫外分光光度计侧定光密度(OD)值，计算RNA浓度。 3.逆转录合成。DNA 反应程序:42℃1小时，94℃2分钟，逆转录反应产物一20弋冻存备用。 4.PCR反应检测饰DNA及GApD妞DNA 反应程序:94℃2分钟;94℃1分钟叶56℃1分钟一刀2℃1分钟，34个循环;72℃10分钟，延伸。PCR产物4℃保存备用。 5 .RT一PCR反应的质t控制实验设立:阳性对照、阴性对照、空白对照;防止交叉污染。 6.结果分析: RT一PCR反应产物1 .5%琼脂精凝胶电泳后，应用C日州州比m(Uvps以力)电泳凝胶成像(英国)灰度扫描H洲口廿DH值分析、绘图。结果一、HaCaT细胞照射uvA(12J/e扩)后饰功丑入A表达情况:(一)RT一PCR结果 1.阳性对照:提取珑pGZ细胞总RNA，经逆转录合成cDNA，以引物口钾DH、饰扩增cDNA，可见172坤及197坤扩增片后段2.阴性对照和空白对照:均未扩增出197或172如片段。3.HaCaT细胞:对照组及照射组(20分钟召小时并小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时)分别提取总RNA，逆转录合成cDNA，引物CAPDH、饰扩增后，均出现长度172如及197如片段。 (二)灰度扫描RT‘PCR产物H可口JDH值分析结果: 1.UvA(12J/cmZ)照射E区CaT细胞后饰田RNA表达水平较对照组饰mRNA表达水平明显升高。并且随照射后时间不同，饰mRNA表达水平出现时点变化。20分钟饰mRNA表达水平已开始升高，至6小时达第一高峰，48小时出现第二高峰，之后下降。第二高峰较第一高峰略低。 2.经方差分析，对照组与照射后20分钟组、12小时组、72小时组比较，差异无显著性(P>0.05);对照组与照射后2小时组、4小时组、6小时组、24小时组、48小时组比较，差异有显著性(P<0.05)。二、HacaT细胞uvB(30mJ/c扩)照射后饰mRNA表达情况: (一)RT一PCR结果 1.阳性对照:提取HePGZ细胞总RNA，经逆转录合成cDNA后，以引物GAPDH、Hp扩增后，可见172bp及197如片段; 2.阴性对照和空白对照:均未扩增出197或172bp片段。 3 .HaCaT细胞:对照组及照射组(20分钟、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时)分别提取总RNA，并逆转录合成cDNA，以引物Q汗DH、Hp扩增后，可见172坤及197bp片段。 (二)灰度扫描RT一PCR产物Hp/GApDH值分析结果: 1 .HacaT细胞UvB( 30tnJ/cmZ)照射后Hp mRNA表达水平较对照组明显升高。并且随照射后时间不同，饰mRNA表达水平出现时点变化。20分钟饰mRNA表达水平已开始升高，至4小时达第一高峰，之后略有下降，铭小时出现第二高峰，之后下降。第二高峰较第一高峰略低。 2.经方差分析，对照组与照射后筑小时组比较，差异无显著性(P>0.05);对照组与照射后20分钟组、2小时组、4小时组、6小时组、12小时组、48小时组、72小时组比较，差异有显著性(P<0·05)。结论 1.紫外线UVA、UVB均可使HaCaT细胞HP mRNA表达水平明显升高。 2.紫外线UVA、UvB照射后HaCaT细胞饰mRNA表达水平呈时点变化。

全文目录

一、中文摘要  3-7
二、英文摘要  7-11
三、英文缩略语  11-12
四、论文主体  12-27
  1 前言  12-13
  2 实验材料与方法  13-18
  3 实验结果  18-23
  4 讨论  23-26
  5 结论  26-27
五、本研究新见解  27-28
六、参考文献  28-31
七、致谢  31-32
八、综述  32-44
九、个人简介  44

紫外线对HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达的影响

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