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金属调控2型糖尿病相关蛋白胰岛淀粉样多肽聚集过程

作　者: 于冶萍
导　师: 李艳梅
学　校: 清华大学
专　业: 化学
关键词: 2型糖尿病人胰岛淀粉样多肽(hIAPP) 细胞毒性聚集金属离子
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

胰岛中的淀粉样沉积是2型糖尿病的重要病理特征。人胰岛素多肽(hIAPP)是胰岛淀粉样沉积的主要组成部分,由37个氨基酸残基组成。研究表明hIAPP聚集成的纤维丝与胰岛β细胞功能缺失有关,而hIAPP诱导的细胞毒性机理主要包括可溶性寡聚体的形成、细胞膜破损、细胞膜通透性增大以及氧化压力。最新的证据表明,金属在淀粉样沉积的过程中起到重要的作用。Cu、Zn等金属离子在阿尔兹海默氏症等神经退行性疾病中有重要意义,金属离子可以与淀粉样蛋白结合并改变聚集机理。但是目前金属与hIAPP相互作用的机理仍不清楚。本工作主要研究了生命体系中常见的Cu、Ni、Zn等金属离子对hIAPP聚集过程和细胞毒性的影响,以及Ta表面诱导的hIAPP聚集机理。首先,本文发现了一个Cu诱导hIAPP形成具有细胞毒性的球形寡聚体的机理。Cu一方面抑制hIAPP纤维丝状聚集体的形成,另一方面诱导其聚集成为小尺寸球形寡聚体,从而增强hIAPP诱导的β细胞毒性。本文进一步利用Ni重现了Cu的这种影响,因为Ni与Cu在与蛋白结合的性质方面十分类似,却不产生任何氧化压力。研究发现,Ni也可以通过诱导毒性寡聚体的产生而提高hIAPP的细胞毒性。这些数据证明Cu诱导的hIAPP产生更大细胞毒性的主要原因不是氧化压力,而是毒性更大的球形寡聚体的产生。与Cu和Ni不同的是,Zn通过诱导hIAPP变成β折叠构象,从而对hIAPP的聚集过程有促进的作用。由于Zn缩短了hIAPP聚集的成核期,使得hIAPP由单体迅速的过度到细胞毒性较小的纤维状聚集体状态,毒性寡聚体及其他形式聚集中间体的存在时间被大大缩短,因此减小了hIAPP诱导的细胞毒性。本文还利用Ta金属表面研究了表面诱导的hIAPP聚集机理。结果发现hIAPP在溶液中聚集成的纤维丝具有三维的节状结构:纤维丝之间交联缠绕而形成更粗的成熟纤维丝,并进一步聚集成为聚集体团簇和淀粉样斑块。而Ta表面诱导的hIAPP机理与之不同:带负电荷的表面首先吸附hIAPP单体,然后聚集成为寡聚体并继续生长成为原纤维丝,寡聚体进一步结合在原纤维丝上,延长纤维丝的长度,进而形成没有节状结构的纤维丝。这些结果证明了金属诱导的细胞毒性的新机理,揭示了金属在2型糖尿病病理途径中的重要作用。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-10
第1章引言  10-24
  1.1 2 型糖尿病病理途径  11-13
    1.1.1 胰岛素抵抗  11-12
    1.1.2 胰岛β-细胞衰竭  12-13
  1.2 胰岛淀粉样沉积  13-14
  1.3 胰岛淀粉样多肽  14-16
  1.4 胰岛淀粉样多肽、胰岛淀粉样沉积和2 型糖尿病  16
  1.5 胰岛淀粉样沉积聚集机理  16-17
  1.6 胰岛淀粉样沉积产生细胞毒性机理  17-20
  1.7 Cu、Zn 与2 型糖尿病  20-21
    1.7.1 金属离子与葡萄糖代谢  20-21
    1.7.2 金属离子与氧化压力  21
  1.8 国内外研究金属与胰岛淀粉样多肽关系的研究现状  21-23
    1.8.1 Cu 抑制淀粉样蛋白聚集  22
    1.8.2 Cu 产生氧化压力  22-23
  1.9 本论文研究内容  23-24
第2章 Cu(II)对hIAPP 聚集过程及细胞毒性的影响  24-58
  2.1 本章引论  24
  2.2 实验部分  24-42
    2.2.1 仪器、试剂及样品配制  24-26
    2.2.2 实验原理及方法  26-42
      2.2.2.1 细胞活力测定  26-27
      2.2.2.2 细胞凋亡检测  27-29
      2.2.2.3 金属离子的电子顺磁共振检测  29-30
      2.2.2.4 蛋白分子质量的MALDI-TOF/MS 法检测  30-33
      2.2.2.5 蛋白质的拉曼光谱检测  33-34
      2.2.2.6 蛋白构象的圆二色谱光谱  34-35
      2.2.2.7 多肽聚集的ThT 荧光检测  35-36
      2.2.2.8 多肽的酪氨酸内源荧光检测  36
      2.2.2.9 聚集形态的电镜检测  36-38
      2.2.2.10 聚集形态的原子力显微镜检测  38
      2.2.2.11 聚集体含量的动态光散射检测  38-39
      2.2.2.12 蛋白质交联  39-40
      2.2.2.13 蛋白质含量的凝胶电泳法检测  40-41
      2.2.2.14 H2O2 生成量测定  41-42
  2.3 实验结果  42-56
    2.3.1 Cu(II)对hIAPP 细胞毒性的影响  42-43
    2.3.2 Cu(II)对hIAPP 诱导的细胞凋亡的影响  43-45
    2.3.3 Cu(II)与hIAPP 的结合  45-48
      2.3.3.1 Cu(II)与hIAPP 的结合  45
      2.3.3.2 Cu(II)与hIAPP 结合形成复合物  45-46
      2.3.3.3 Cu(II)与hIAPP 的结合位点初探  46-48
    2.3.4 Cu(II)对hIAPP 构象的影响  48-49
    2.3.5 Cu(II)对hIAPP 聚集动力学的影响  49-51
    2.3.6 Cu(II)对hIAPP 聚集形貌的影响  51-52
    2.3.7 Cu(II)对hIAPP 聚集尺度的影响  52-54
    2.3.8 Cu(II)与hIAPP 作用产生氧化压力  54-55
    2.3.9 金属螯合剂对hIAPP 损伤细胞的保护作用  55-56
  2.4 本章讨论  56-57
  2.5 本章小结  57-58
第3章 Ni(II)对hIAPP 聚集过程及细胞毒性的影响  58-71
  3.1 本章引论  58
  3.2 实验部分  58-61
    3.2.1 仪器、试剂及样品配制  58-60
    3.2.2 实验原理及方法  60-61
      3.2.2.1 蛋白分子质量的MALDI-TOF/MS 法检测  60
      3.2.2.2 多肽聚集的ThT 荧光检测  60
      3.2.2.3 多肽的酪氨酸内源荧光检测  60
      3.2.2.4 聚集形态的电镜检测  60
      2.2.2.5 聚集形态的原子力显微镜检测  60
      3.2.2.6 蛋白质交联  60
      3.2.2.7 蛋白质含量的凝胶电泳法检测  60
      3.2.2.8 H2O2 生成量测定  60-61
      3.2.2.9 细胞活力测定  61
  3.3 实验结果  61-68
    3.3.1 Ni(II)与hIAPP 的结合  61
    3.3.2 Ni(II)对hIAPP 聚集动力学的影响  61-64
    3.3.3 Ni(II)对hIAPP 聚集形貌的影响  64-65
    3.3.4 Ni(II)对hIAPP 聚集尺度的影响  65-66
    3.3.5 Ni(II)与hIAPP 作用不产生氧化压力  66-67
    3.3.6 Ni(II)对hIAPP 细胞毒性的影响  67-68
  3.4 本章讨论  68-69
  3.5 本章小结  69-71
第4章 Zn(II)对hIAPP 聚集过程及细胞毒性的影响  71-79
  4.1 本章引论  71
  4.2 实验部分  71-73
    4.2.1 仪器、试剂及样品配制  71-73
    4.2.2 实验原理及方法  73
      4.2.2.1 多肽聚集的ThT 荧光检测  73
      4.2.2.2 多肽聚集的光散射检测  73
      4.2.2.3 聚集形态的电镜检测  73
      4.2.2.4 蛋白构象的圆二色谱光谱  73
      4.2.2.5 细胞活力测定  73
  4.3 实验结果  73-78
    4.3.1 Zn(II)对hIAPP 聚集动力学的影响  73-75
    4.3.2 Zn(II)对hIAPP 聚集形貌的影响  75-76
    4.3.3 Zn(II)对hIAPP 构象的影响  76
    4.3.4 Zn(II)对hIAPP 细胞毒性的影响  76-78
  4.4 本章讨论  78
  4.5 本章小结  78-79
第5章 Ta 表面诱导的hIAPP 聚集过程  79-99
  5.1 本章引论  79-80
  5.2 实验方法  80-82
    5.2.1 仪器、试剂及样品配制  80
    5.2.2 实验原理及方法  80-82
      5.2.2.1 多肽聚集的ThT 荧光检测  80
      5.2.2.2 聚集形态的电镜检测  80
      5.2.2.4 聚集形态的原子力显微镜检测  80
      5.2.2.5 石英晶体微天平  80-82
  5.3 实验结果  82-97
    5.3.1 溶液中hIAPP 的聚集动力学  82
    5.3.2 溶液中hIAPP 的聚集形貌  82-87
    5.3.3 Ta 表面诱导的hIAPP 的聚集动力学  87-91
    5.3.4 Ta 表面诱导的hIAPP 的聚集形貌  91-94
    5.3.5 Ta 表面诱导的hIAPP 的聚集机理初探  94-97
  5.4 本章讨论  97-98
  5.5 本章小结  98-99
结论  99-100
参考文献  100-116
致谢  116-117
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  117

金属调控2型糖尿病相关蛋白胰岛淀粉样多肽聚集过程

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