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阿糖胞苷对cFLIP_L mRNA在急性白血病原代细胞表达的影响

作　者: 赵瑞
导　师: 刘延方
学　校: 郑州大学
专　业: 内科学
关键词: 急性白血病 cFLIP_L 阿糖胞苷 RT-PCR
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


背景和目的细胞凋亡与坏死是完全不同的死亡方式。前者是一种由基因控制的自主性、程序性死亡,其对保持组织的健康和正常生长有十分重要的意义。细胞凋亡过程受抑,可使细胞生存期延长,将利于转化突变的细胞生长积聚,最终致使肿瘤的产生。细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达以及酶类和信号传导途径的调控。目前发现机体内存在两类影响细胞凋亡的基因,即促凋亡基因如Reaper、Smac/DIABLO、Bax、HtrA2和抗凋亡基因如Bcl-2、P53、XIAP、CrmA及cFLIP（细胞型Fas相关死亡区域蛋白样白介素Ⅰ转换酶抑制蛋白,cFLIP）。cFLIP是新发现的细胞凋亡抑制蛋白,包括长型和短型两种亚型,即cFLIPL和cFLIPS。该蛋白在结构上与caspase-8类似,但不具备caspase-8的蛋白水解酶活性。它与含死亡结构域的Fas相关蛋白（FADD）结合后,可竞争性地阻断capsase-8与FADD的结合,使得capsase-8不能被活化,caspase-8介导的蛋白酶级联反应不能进行,从而阻断了Fas介导的细胞内凋亡信号转导通路中的关键环节,使肿瘤细胞免于凋亡。急性白血病是一种恶性血液病,大约占癌症总发病率的5%。近年来,其发病率和死亡率呈上升趋势,但其发病机制仍不十分清楚。因此,急性白血病的病因学和发病机制仍是目前研究的热点。本文应用逆转录酶/聚合酶链反应（RT-PCR）法检测cFLIPL mRNA的表达水平,探讨在cFLIPL mRNA急性白血病原代细胞表达及阿糖胞苷（Ara-C）对cFLIPL mRNA在急性白血病细胞表达的影响,从而为揭示白血病的发病机理提供一定的帮助。材料与方法1.病例资料:26例患者的骨髓样本均取自郑州大学第一附属医院血液科2008年4月～2008年12月住院患者。平均年龄:40岁（16岁-63岁）,其中男16例,女10例。经过血常规、骨髓细胞形态学、细胞化学、免疫表型及细胞遗传学确诊,符合急性白血病的诊断标准（张之南主编的《血液病诊断及疗效标准（第三版）》）。10例非恶性血液病患者作为对照组,平均年龄38岁（21岁-57岁）,其中男4例,女6例。2.细胞培养取26例初诊的急性白血病患者肝素抗凝骨髓5ml,密度梯度离心分离单个核细胞,洗涤2次后分2组在培养瓶中进行体外培养:未处理组、Ara-C处理组（Ara-C浓度为120μg/ml）,同时取非恶性血液病患者（10例）作为对照组,密度梯度离心分离骨髓单个核细胞,洗涤2次后调整细胞浓度为1×107/ml。在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养24小时。3.RT-PCR方法收获培养的细胞,沈涤后用TRIZOL法提取RNA,逆转录试剂盒合成cDNA,化学合成针对cFLIPL mRNA的探针,并以β-actin做内对照,在扩增仪中进行25个循环的PCR反应。将PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳,紫外线观察并测定相关条带的光密度值后,计算扩增的cFLIPL mRNA与β-actinmRNA的灰度比值,以cFLIPL mRNA/β-action mRNA的比值表示目的基因cFLIPLmRNA的相对表达水平。4.应用SPSS13.0统计软件进行统计分析,对计数资料采用X2检验,统计学数据用均数士标准差（（??）±s）表示。两样本均数的比较采用配对资料的t检验,多样本均数的比较采用方差分析。以α=0.05作为检验水准。结果1.在初治的急性白血病患者26例中,20例患者骨髓单个核细胞表达cFLIPLmRNA,阳性率为76.9%（20/26）。在对照组中仅一例表达,表达率为10.0%（1/10）。cFLIPL mRNA在初治的AL中的阳性表达率高于正常对照组（X2=4.511,P=0.034）。在20例表达cFLIPL mRNA的患者中,其表达量为0.47±0.140,对照组1例阳性者表达量为0.19。2.cFLIPL在不同系列急性白血病的表达:在19例急性髓系白血病（AML）患者中15例患者骨髓单个核细胞表达cFLIPL mRNA,其阳性表达率为81.3%;在7例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中5例患者骨髓单个核细胞表达cFLIPLmRNA,其阳性表达率71.4%,但两组间差别无统计学意义（P＞0.05）。在15例表达cFLIPL mRNA的AML患者中,其表达量为0.49±0.152,在5例表达cFLIPLmRNA的ALL患者中,其表达量为0.45±0.127（X2=0.022,P=0.883）;两组cFLIPLmRNA表达量均高于对照组（X2=19.81,P=0.00）。3.阿糖胞苷对cFLIPL mRNA在急性白血病表达的影响:用120μg/ml Ara-C作用急性白血病患者骨髓单个核细胞24h后,显著下调cFLIPL mRNA的表达水平;与未加药组相比,加药组cFLIPL mRNA表达水平明显下调,差异具有显著性（P＜0.01）;Ara-C处理组cFLIPL mRNA在急性白血病中的表达水平仍较正常对照组高,但差异不具有统计学意义（P＞0.05）。4.急性白血病骨髓单个核细胞cFLIPL mRNA表达水平与临床疗效的关系:本组26例急性白血病患者接受标准化疗方案治疗1疗程后评估疗效,其中20例cFLIPL mRNA高表达者CR率为60.00%,6例不表达者CR率为83.33%。两组间差别有显著性意义（X2=7.231,P=0.026）。结论1.急性白血病细胞中cFLIPL mRNA的表达水平显著高于非恶性血液病骨髓细胞的表达水平。2.急性髓系白血病与急性淋巴细胞白血病细胞中cFLIPL mRNA的表达水平无显著性差异。3.Ara-C能够下调急性白血病细胞中cFLIPL mRNA的表达水平。4.cFLIPL表达高者,其临床缓解率低,提示cFLIPL可以作为预测急性白血病临床疗效的一种有效指标。

全文目录


摘要  3-6
Abstract  6-11
论文部分 阿糖胞苷对CFLIP_L MRNA在急性白血病原代细胞表达的影响  11-33
  前言  11-13
  材料与方法  13-18
  结果  18-21
  讨论  21-27
  参考文献  27-31
  附图  31-33
综述 CFLIP与细胞凋亡及肿瘤的发生发展  33-46
  参考文献  40-46
英文缩略词索引  46-47
攻读硕士期间发表论文情况  47-48
致谢  48

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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