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耐辐射球菌中抗氧化蛋白Dps（DRB0092）的研究

作　者: 严卓彦
导　师: 华跃进
学　校: 浙江大学
专　业: 生物物理学
关键词: 耐辐射球菌 Dps蛋白生物信息学基因突变抗氧化 DNA保护
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 71次
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内容摘要

耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans）是地球上已知的辐射抗性最强的生物之一，它以对电离辐射、紫外线、干燥以及一系列DNA损伤试剂显示超强的抗性而著称。已有的研究显示，抗氧化保护体系和高效的DNA损伤修复能力是该菌具有超强抗性的关键因素。然而，耐辐射球菌体内存在的这种极端抗性机制至今仍不明确。因此，研究和鉴定耐辐射球菌体内DNA保护及抗氧化相关的功能蛋白（或酶），阐明它们的生物学功能和生化特性，对进一步理解耐辐射球菌的极端抗性机制和探索其潜在的应用价值具有非常重要的意义。Dps（DNA protection during starvation）蛋白是一类只存在于原核生物中具有抵抗多种逆境压力功能的含铁蛋白，与真核生物铁蛋白（Ferritin）和细菌铁蛋白（Bacterioferritin）共同组成铁蛋白超家族。Dps蛋白能通过两种机制有效保护DNA免受损伤：1)Dps能结合游离态亚铁离子，从而防止多余的Fe²⁺和H₂O₂发生Fenton反应产生羟自由基攻击DNA；2)Dps蛋白与DNA直接结合形成结构致密的蛋白-DNA生物共结晶体，从而在物理形态上保护DNA免受活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）等有害物质的攻击。耐辐射球菌全基因组中有两个基因编码Dps蛋白，分别是位于Ⅰ号染色体上的DR2263和位于大质粒上的DRB0092基因。关于前者的生化特性和晶体结构特征已有详细的文献报道。本研究围绕后者，应用生物信息学和分子生物学的方法进行鉴定，并对其基因功能和蛋白生化特性进行分析。研究结果如下：1．运用生物信息学方法对DRB0092基因和蛋白序列进行分析。发现DRB0092蛋白存在类似Ferritin（铁蛋白）的保守结构域，进一步证明了该蛋白属于铁蛋白超家族。通过ClustalW程序对DRB0092蛋白和其它细菌Ops蛋白进行多序列比对，结果显示DRB0092蛋白与其它物种Dps蛋白的同源性并不高，但其N-端前端存在富含赖氨酸（Lys）保守位点的区域，可能为DNA结合结构域；蛋白中部存在His100、Asp127和Glu131等保守氨基酸残基，推测为铁氧化酶（ferroxidase）保守结构域。此外，分析结果显示DRB0092蛋白在其N-端还具有其它Dps蛋白没有的信号肽，预示着DRB0092蛋白可能具有其它Dps蛋白不具有的生化特性。2．用体外三段连接和体内同源重组的方法对DRB0092进行全基因缺失突变。分析突变株和野生型菌株在电离辐照和过氧化氢处理下的生存率曲线，结果显示突变株的生存率较野生型均有明显下降，而突变株补偿Dps蛋白则能完全恢复野生型的表型。此外，Native-PAGE活性染色结果表明，DRB0092的缺失导致耐辐射球菌体内过氧化氢酶（CAT）活性上调，H₂O₂压力条件下差异尤为显著。3．通过在大肠杆菌中过表达DRB0092重组蛋白，我们得到纯化的Dps-2重组蛋白，并对其进行体外生化功能鉴定。结果显示：在交联剂戊二醛作用下，含50mM NaCl的缓冲液中的单体Dps-2蛋白能形成三聚体、四聚体和十二聚体等各种多聚体形式；单体Dps-2蛋白不能结合pUC19质粒，但多聚体Dps-2蛋白能与质粒DNA发生非特异性结合，并能保护质粒DNA免受Fe²⁺和H₂O₂发生Fenton反应产生的羟自由基损伤。综上所述，耐辐射球菌的Dps-2蛋白（DRB0092）具有明显的DNA保护和抗氧化功能，在该菌的抗氧化体系中扮演举足轻重的角色，可能是该菌极端抗性机制的重要组成部分。

全文目录

摘要  9-11
Abstract  11-14
第一章文献综述  14-41
  第一节耐辐射球菌的研究综述  14-21
    1.耐辐射球菌的生理和生化特性  14-15
    2.耐辐射球菌的基因组分析  15-16
    3.耐辐射球菌的抗辐射机制  16-18
    4.耐辐射球菌的DNA损伤修复方式  18-20
    5.耐辐射球菌的抗氧化机制  20-21
  第二节细菌Dps蛋白的研究综述  21-31
    1.Dps蛋白的结构  22-24
    2.Dps蛋白的特性  24-26
    3.不同细菌中的Dps蛋白及其功能  26-29
    4.Dps蛋白的研究意义  29-31
  参考文献  31-41
第二章耐辐射球菌DRB0092基因和蛋白的生物信息学分析  41-53
  第一节引言  41
  第二节材料和方法  41-42
    2.1 数据来源  41-42
    2.2 研究方法  42
  第三节结果和分析  42-51
    3.1 DRB0092基因在染色体上的位置和基本特性分析  42-44
    3.2 DRB0092基因密码子偏好性分析  44-45
    3.3 DRB0092基因启动子预测分析  45-46
    3.4 DRB0092蛋白结构域的搜索和鉴定  46-47
    3.5 DRB0092蛋白保守结构域的同源比对和活性位点分析  47-49
    3.6 DRB0092蛋白同源物进化树分析  49-51
  第四节讨论  51-52
  参考文献  52-53
第三章耐辐射球菌DRB0092突变株的构建和基因功能分析  53-71
  第一节引言  53-54
  第二节材料和方法  54-60
    2.1 实验菌株和生长特性  54-55
    2.2 主要试剂和仪器  55-56
    2.3 耐辐射球菌和大肠杆菌感受态的制备和转化  56-57
    2.4 DRB0092基因突变株的构建  57-58
    2.5 补偿质粒的构建  58-59
    2.6 γ射线(~(60)Co)辐照处理  59
    2.7 H_2O_2处理  59
    2.8 过氧化氢酶活性检测  59-60
  第三节结果与分析  60-67
    3.1 DRB0092突变株的构建及鉴定  60-62
    3.2 D92补偿菌株的构建和鉴定  62-63
    3.3 γ射线辐照条件下突变株的存活率  63-64
    3.4 H_2O_2氧化压力条件下突变株和野生型菌株的生存率比较  64-65
    3.5 dps缺失对耐辐射球菌过氧化氢酶活性的影响  65-67
  第四节讨论  67-68
  参考文献  68-71
第四章耐辐射球菌DRB0092蛋白的生化特性研究  71-85
  第一节引言  71-72
  第二节材料和方法  72-76
    2.1 实验菌株与质粒  72-73
    2.2 实验试剂和仪器  73
    2.3 DRB0092基因的体外克隆和表达质粒的构建  73-74
    2.4 DRB0092蛋白的表达  74
    2.5 DRB0092蛋白的纯化  74-75
    2.6 Dps蛋白体外交联实验  75
    2.7 Dps蛋白与DNA的体外结合和保护实验  75-76
  第三节结果和分析  76-80
    3.1 DRB0092蛋白表达质粒和表达菌株的构建  76-77
    3.2 DRB0092蛋白表达和纯化  77
    3.3 Dps蛋白体外交联实验  77-78
    3.4 Dps蛋白体外DNA结合试验  78-79
    3.5 Dps蛋白体外DNA保护试验  79-80
  第四节讨论  80-82
  参考文献  82-85
第五章总结  85-87
硕士期间发表论文  87-88
致谢  88

耐辐射球菌中抗氧化蛋白Dps（DRB0092）的研究

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