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γ-聚谷氨酸的异源表达及发酵工艺研究

作　者: 曹旭
导　师: 徐志南
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 聚-γ-谷氨酸基因工程 Bacillus subtilis ZJU-7 培养条件优化氮源替代
分类号: TQ922.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

聚-γ-谷氨酸是一种由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体通过γ-羧基与α-氨基形成的肽键缩合而成的一种聚阴离子类多肽分子。其分子量一般在100～1000kDa之间，相当于500～5000个左右的谷氨酸单体。作为一种生物高分子材料，γ-PGA具有生物可降解性好、可食、对人体和环境无毒害的优点。目前已经确定编码γ-PGA合成酶系的全部基因(pgsB、pgsC、pgsA)。本论文以大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌为宿主进行γ-PGA的异源表达研究。从Bacillus subtilis ZJU-7中克隆得到了pgsB、pgsC、pgsA三个基因，采用了pTrc99a和pXMJ19两种质粒作为载体，分别构建了pTrc99a-pgsBCA和pXMJ19-pgsBCA两个重组表达质粒。选取E.coli JM109、E.coli BL21、Corynebacterium glutamicum RES167为宿主，分别构建了E.coliJM109／pTrc99a-pgsBCA、E.coli BL21／pXMJ19-pgsBCA、Corynebacteriumglutamicum RES167／pTrc99a-pgsBCA、Corynebacterium glutamicumRES167／pXMJ19-pgsBCA共4个重组菌株。并且对各个重组菌株的γ-PGA合成能力进行了鉴定。其中E.coli JM109／pTrc99a-pgsBCA、E.coli BL21／pXMJ19-pgsBCA、Corynebacterium glutamicum RES167／pXMJ19-pgsBCA具备了γ-PGA的合成能力。并且对E.coli BL21／pXMJ19-pgsBCA的培养条件进行了优化。得到了以下的培养基成分：蔗糖10g／L，蛋白胨10g／L，L-谷氨酸10g／L，NaCl10g／L，1mM MnSO4，氯霉素34μg／ml，IPTG 1mM。使用以上的培养基配方，γ-PGA的产量达到了1.17g／L。对本实验室保藏的一株聚-γ-谷氨酸高产菌株(Bacillus subtilis ZJU-7)进行了复壮，从中筛选出一株相对高产的菌株，摇瓶发酵产量达到48 g／L。并且对Bacillus subtilis ZJU-7进行了摇瓶培养条件优化。在此基础上，在15L发酵罐上对发酵过程进行了初步的放大研究，γ-PGA产量达到了23 g／L。针对Bacillus subtilis ZJU-7发酵过程中需要添加大量的蛋白胨引起发酵成本过高的问题，进行了Bacillus subtilis ZJU-7发酵培养基中氮源替代的初步研究，考察了鱼粉、玉米粉等廉价氮源对γ-PGA产量的影响。当使用玉米粉作为氮源时，培养基中氮源成本最低，达到5元／kgγ-PGA。

全文目录

摘要  9-11
Abstract  11-13
第一章绪论  13-32
  1.1 γ-多聚谷氨酸(poly-γ-glutamica cid,γ-PGA)的分子结构  13-14
  1.2 γ-PGA的合成方法  14-16
    1.2.1 提取法制备γ-PGA  14
    1.2.2 化学合成法  14-15
    1.2.3 酶转化法  15-16
    1.2.4 微生物发酵法  16
  1.3 微生物法生产γ-PGA的主要菌株  16-18
  1.4 γ-PGA工业化生产  18-19
  1.5 γ-PGA发酵生产的主要影响因素  19-22
    1.5.1 碳源对γ-PGA发酵生产的影响  19-20
    1.5.2 氮源对γ-PGA发酵生产的影响  20
    1.5.3 谷氨酸对γ-PGA发酵生产的影响  20-21
    1.5.4 金属离子对γ-PGA发酵生产的影响  21
    1.5.5 供氧和pH对γ-PGA发酵生产的影响  21-22
  1.6 γ-PGA的分离纯化  22
  1.7 γ-PGA的生物合成机理  22-24
  1.8 γ-PGA合成酶系及其相关基因  24-26
    1.8.1 γ-PGA合成酶系  24
    1.8.2 γ-PGA合成酶系的相关基因  24-26
  1.9 γ-PGA的性质及应用  26-30
    1.9.1 γ-PGA的性质  26
    1.9.2 γ-PGA的应用  26-30
      1.9.2.1 γ-PGA在医药领域的应用  27-29
      1.9.2.2 γ-PGA在农业领域的应用  29
      1.9.2.3 γ-PGA的其他用途  29-30
  1.10 本课题主要研究内容  30-32
第二章实验材料与方法  32-41
  2.1 菌种与质粒  32
  2.2 仪器与试剂  32-33
    2.2.1 主要仪器  32-33
    2.2.2 主要试剂及标准品  33
    2.2.3 工具酶及试剂盒  33
  2.3 培养基和培养条件  33-35
    2.3.1 主要培养基  33-34
    2.3.2 培养方法  34-35
  2.4 分析测定方法  35-41
    2.4.1 pH测定  35-36
    2.4.2 含菌量测定  36
    2.4.3 γ-PGA的分离纯化  36
    2.4.4 γ-PGA的盐酸水解  36
    2.4.5 γ-PGA测定方法  36-38
      2.4.5.1 酸水解法测定法  36-37
      2.4.5.2 直接测定法  37
      2.4.5.3 HPCE测定法  37-38
    2.4.6 谷氨酸含量测定方法  38
    2.4.7 发酵液中糖含量的测定方法  38-39
      2.4.7.1 还原糖浓度测定  38-39
      2.4.7.2 蔗糖浓度测定  39
    2.4.8 大肠杆菌细胞超声破碎及胞内蛋白提取  39-40
    2.4.9 SDS-PAGE电泳  40
    2.4.10 发酵液粘度测定  40-41
第三章 γ-PGA合成酶系相关基因的克隆及表达载体的的构建  41-69
  3.1 前言  41-42
  3.2 材料与方法  42-47
    3.2.1 菌株、质粒载体及PCR引物  42-43
    3.2.2 培养基  43
    3.2.3 DNA操作工具酶和试剂盒  43
    3.2.4 Bacillus subtilis ZJU-7基因组的提取  43-44
    3.2.5 大肠杆菌质粒DNA的提取(碱法)  44-45
    3.2.6 CaCl_2法制作热休克转化感受态细胞(大肠杆菌)  45
    3.2.7 PCR反应扩增目的基因pgsB、pgsC、pgsA  45-46
    3.2.8 PCR反应产物片断与pMD-T simple vector的连接  46
    3.2.9 大肠杆菌的热休克转化及阳性克隆的筛选  46-47
    3.2.10 DNA的检测  47
    3.2.11 琼脂糖凝胶电泳后回收所需的DNA片断  47
  3.3 实验结果与讨论  47-69
    3.3.1 重组质粒pTrc99A-pgsBCA的构建  47-61
      3.3.1.1 PCR反应扩增目的基因pgsB、pgsC、pgsA及测序结果  47-50
      3.3.1.2 测定PCR反应扩增得到的目的基因pgsB、pgsC、pgsA的序列  50-54
      3.3.1.3 酶切得到保存在T载体上的pgsB、pgsC、pgsA基因  54-56
      3.3.1.4 双酶切质粒pTrc99A得到可同时连接pgsB、pgsC、pgsA基因的载体  56-58
      3.3.1.5 克隆pgsB、pgsC、pgsA基因到质粒pTrc99A上,及阳性克隆的筛选  58-60
      3.3.1.6 小结  60-61
    3.3.2 重组质粒pXMJ19-pgsBCA的构建  61-69
      3.3.2.1 PCR反应扩增目的基因pgsBCA  61-63
      3.3.2.2 酶切得到保存在T载体上的pgsBCA基因及双酶切质粒pXMJ19得到可连接pgsBCA基因的载体  63-65
      3.3.2.3 克隆pgsBCA基因到质粒pXMJ19上,及阳性克隆的筛选  65-67
      3.3.2.4 小结  67-69
第四章在大肠杆菌中表达γ-PGA  69-77
  4.1 前言  69
  4.2 实验材料和方法  69-71
    4.2.1 菌株  69
    4.2.2 质粒  69
    4.2.3 培养基  69-70
    4.2.4 分子克隆相关实验  70
      4.2.4.1 质粒提取  70
      4.2.4.2 感受态细胞的制备及质粒转化  70
      4.2.4.3 DNA检测  70
    4.2.5 重组大肠杆菌的培养方法  70-71
    4.2.6 发酵液中γ-PGA的提取及鉴定  71
  4.3 实验结果与讨论  71-76
    4.3.1 重组E.coli JM109/pTrc99A-pgsBCA的构建  71-72
    4.3.2 pgsBCA在E.coli JM109中的表达及表达产物的鉴定  72-73
    4.3.3 重组E.coli BL21/pXMJ19-pgsBCA的构建  73
    4.3.4 pgsBCA在E.coli BL21中的表达及表达产物的鉴定  73-75
    4.3.5 重组E.coli BL21/pXMJ19-pgsBCA合成γ-PGA的培养基优化  75-76
  4.4 小结  76-77
第五章在谷氨酸棒状杆菌中表达γ-PGA  77-87
  5.1 前言  77
  5.2 实验材料和方法  77-79
    5.2.1 菌种与质粒  77-78
    5.2.2 培养基  78
    5.2.3 谷氨酸棒状杆菌电激转化感受态细胞的制备  78
    5.2.4 谷氨酸棒状杆菌的电激转化及阳性克隆的筛选  78-79
    5.2.5 重组菌株的培养方法  79
    5.2.6 发酵液中γ-PGA的提取及鉴定  79
  5.3 实验结果及讨论  79-85
    5.3.1 重组谷氨酸棒状杆菌RES167/pTrc99A-pgsBCA的构建  79-81
    5.3.2 重组谷氨酸棒状杆菌RES167/pTrc99A-pgsBCA的摇瓶发酵研究  81
    5.3.3 重组谷氨酸棒状杆菌RES167/pXMJ19-pgsBCA的构建  81-83
    5.3.4 重组谷氨酸棒状杆菌RES167/pXMJ19-pgsBCA的摇瓶发酵研究  83-85
      5.3.4.1 重组质粒对于Corynebbacterium glutamicum RES167生长的影响  83-84
      5.3.4.2 Corynebbacterium glutamicum RES167/pXMJ19-pgsBCA合成γ-PGA能力的鉴定及pgsBCA基因的转录和表达对于Corynebbacterium glutamicum RES167合成谷氨酸的影响  84-85
  5.4 小结  85-87
第六章 Bacillus subtilis ZJU-7发酵工艺研究  87-96
  6.1 前言  87-88
  6.2 材料与方法  88-89
    6.2.1 菌株  88
    6.2.2 培养基  88
    6.2.3 培养方法  88
    6.2.4 测定方法  88-89
  6.3 实验结果与讨论  89-95
    6.3.1 Bacillus subtilis ZJU-7菌株的复壮  89-90
    6.3.2 Bacillus subtilis ZJU-7在种子培养基中生长曲线的测定  90-91
    6.3.3 接种量对γ-PGA产量的影响  91
    6.3.4 搅拌转速对发酵过程的影响  91-93
    6.3.5 Bacillus subtilis ZJU-7发酵培养基氮源替代初步尝试  93-95
  6.4 小结  95-96
结论与展望  96-98
参考文献  98-106
致谢  106-107

γ-聚谷氨酸的异源表达及发酵工艺研究

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