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荧光素及中性红染料间能量转移机理研究及其分析应用

作　者: 张彦青
导　师: 刘保生
学　校: 河北大学
专　业: 分析化学
关键词: 荧光能量转移机理及应用抑制逆向肝素蛋白质
分类号: O657.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

荧光共振能量转移是一种通过荧光物质间发生荧光能量传递进行分析的实验方法。能量转移的应用与单个染料光度测定相比,具有比光度法灵敏度高,与常规荧光法和共振光散射相比受瑞利散射光干扰少,重现性好的特点,该方法已被广泛应用于化学分析、生物结构研究等领域。本文就此类方法进行了初步的机理研究及其相关应用研究,共分以下五部分：第一章：对近年来荧光素类酸性染料及碱性染料中性红在荧光分析中的应用和染料间非辐射荧光共振能量转移的机理研究及在分析化学中的应用进行了较全面的综述,共引用参考文献62篇。第二章：应用荧光光谱法研究了水溶液体系中,酸性染料四溴荧光素(TBF)、四碘荧光素(TIF)、四氯四碘荧光素(TCTIF)、四氯四溴荧光素(TCTBF)分别与碱性染料中性红(NR)之间的相互作用。实验表明：NR对各酸性染料的荧光都有较强的猝灭作用,由荧光猝灭结果求得不同温度下NR与各种酸性染料的结合常数K。发现K值随反应温度上升而下降且随酸性染料取代基的电负性增加而增大,进一步证实了该反应为单一静态猝灭过程。由反应焓变、熵变,确定NR与酸性染料间的结合力主要是静电引力。依据非辐射能量转移机理,得到了不同温度下各酸性染料与NR相互结合时,能量转移效率、能量给体与能量受体间距离r等参数,各体系r<7nm表明该荧光猝灭是通过非辐射能量转移过程产生的。并发现随着染料取代基的电负性增加,能量转移参数的一些变化规律。第三章：四溴荧光素—中性红荧光能量转移抑制法测定肝素。在pH 6.65的Britton-Robinson(B-R)缓冲溶液中,酸性染料四溴荧光素(TBF)与碱性染料中性红(NR)之间由于静电吸引而能够发生有效的能量转移,使得能量受体NR荧光增强,同时能量给体TBF的荧光猝灭。而肝素的加入对该荧光体系间的能量转移产生了明显的抑制作用,随肝素量的增加TBF荧光依次增强,即能量转移过程受到抑制而发生逆转,由此建立了一种测定微量肝素的新方法。结果表明,肝素在0.1～2.0 mg/L范围内与TBF的荧光增强程度呈良好的线性关系,方法检出限0.071 mg/L。该方法用于肝素钠注射液中肝素钠效价的测定,六次平行测定相对标准偏差1.39%～3.59%,回收率95.2%～105.3%,结果满意。第四章：四溴荧光素—中性红逆向能量转移荧光法测定蛋白质。在pH 2.35的B-R缓冲溶液中,酸性染料四溴荧光素(TBF)与碱性染料中性红(NR)之间由于静电吸引能够发生有效的能量转移,使能量受体NR荧光增强,能量给体TBF的荧光猝灭。在该体系中加入人血清白蛋白(HSA),由于竞争作用使得HSA的加入破坏了TBF-NR间的能量转移,产生了明显的逆向反应,并且生成HSA-TBF络合物,利用该络合物的荧光增加强度与HSA含量间的线性关系建立了一种测定微量血清蛋白的新方法。结果表明,血清蛋白的测定范围0.6～12.0 mg/L；方法检出限0.25 mg/L；六次平行测定相对标准偏差1.94%～4.58%；回收率96.3%～104.9%。方法的稳定性好,选择性高,直接用于人血清试样中总蛋白含量的测定,与常用的双缩脲法基本一致。第五章：胶束体系中荧光素与四溴荧光素间能量转移条件及模型研究。研究了阳离子表面活性剂(CSAA)溴代十六烷基三甲铵(CTMAB)及溴代十六烷基吡啶(CPB)在水溶液中与阴离子酸性染料四溴荧光素(TBF)的荧光反应,发现当CSAA单体与TBF形成离子缔合物时,TBF的荧光发生猝灭,而随着CSAA胶束与TBF继续作用又会产生一个新的、更强的荧光。进而研究了阳离子表面活性剂CTMAB及CPB胶束体系中酸性阴离子荧光染料荧光素与TBF间的能量转移条件。结果表明只有在带相反电荷的阳离子表面活性剂形成的胶束环境中,阴离子染料间的能量转移才可能发生,且在2/3临界胶束浓度(CMC)时能量转移效率达到最大。并推测了胶束体系中染料间能量转移模型及染料间能量转移的一般规律。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第1章综述荧光素类染料及中性红在荧光分析中的应用  13-20
  摘要  13
  1.1 荧光素类染料在荧光分析中的应用  13-15
  1.2 中性红染料在荧光分析中的应用  15-16
  1.3 染料间能量转移及在荧光分析中的应用  16-19
    1.3.1 染料间能量转移机理  16-17
    1.3.2 染料间能量转移在荧光分析中的应用  17-19
  1.4 染料间荧光能量转移的发展与展望  19-20
第2章酸、碱染料间能量转移机理的研究:荧光素-中性红体系  20-27
  摘要  20
  2.1 引言  20-21
  2.2 实验部分  21
    2.2.1 仪器和试剂  21
    2.2.2 实验方法  21
  2.3 结果与讨论  21-26
    2.3.1 酸性染料与NR的荧光猝灭反应  21-24
    2.3.2 酸性染料与中性红主要结合力的确定  24
    2.3.3 特定结合部位微环境研究  24-26
  2.4 结论  26-27
第3章四溴荧光素—中性红荧光能量转移抑制法测定肝素  27-33
  摘要  27
  3.1 引言  27
  3.2 实验部分  27-28
    3.2.1 仪器与试剂  27-28
    3.2.2 实验方法  28
  3.3 结果与讨论  28-32
    3.3.1 TBF-NR间的能量转移  28-29
    3.3.2 肝素对TBF-NR能量转移体系的影响  29-30
    3.3.3 酸度的影响  30
    3.3.4 四溴荧光素、中性红的用量选择  30
    3.3.5 反应时间、体系稳定性及加样顺序的影响  30-31
    3.3.6 共存物质的影响  31
    3.3.7 工作曲线、线性范围及检出限  31
    3.3.8 样品分析  31-32
  3.4 结论  32-33
第4章四溴荧光素—中性红逆向能量转移荧光法测定蛋白质  33-40
  摘要  33
  4.1 引言  33
  4.2 实验部分  33-34
    4.2.1 仪器与试剂  33-34
    4.2.2 实验方法  34
  4.3 结果与讨论  34-39
    4.3.1 TBF-NR间的能量转移  34-35
    4.3.2 蛋白质对TBF-NR能量转移体系的影响  35-36
    4.3.3 酸度的影响  36
    4.3.4 四溴荧光素、中性红的用量及能量转移效率  36-37
    4.3.5 反应时间及加样顺序的影响  37-38
    4.3.6 共存物质的影响  38
    4.3.7 工作曲线及检出限  38
    4.3.8 样品分析  38-39
  4.4 结论  39-40
第5章胶束体系中荧光素与四溴荧光素间能量转移条件及模型研究  40-46
  摘要  40
  5.1 引言  40
  5.2 实验部分  40-41
    5.2.1 仪器与试剂  40-41
    5.2.2 实验方法  41
  5.3 结果与讨论  41-44
    5.3.1 阳离子表面活性剂与酸性染料单体的反应  41-42
    5.3.2 表面活性剂对能量转移体系得影响  42-43
    5.3.3 荧光素与TBF浓度对能量转移效率(η)的影响  43-44
  5.4 能量转移模型  44
  5.5 结论  44-46
参考文献  46-53
附录在读期间发表的学术论文  53-54
致谢  54

荧光素及中性红染料间能量转移机理研究及其分析应用

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