环糊精葡萄糖基转移酶(CGTases; EC 2.4.1.19)为食品工业中重要的酶,可利用淀粉作为底物生产以α-1,4糖苷键连接的环状低聚糖——环糊精；亦可用于生产具有新特性的低聚糖。利用碱耐受菌株Bacillus licheniformis SK13.002,研究了利用不同碳" />

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Bacillus Licheniformis SK13.002产具高淀粉水解活性环糊精葡萄基转移酶的生产、纯化及β-环糊精生产应用的研究

作　者: Rebaone Letsididi
导　师: 江波
学　校: 江南大学
专　业: 食品科学
关键词: 环糊精葡萄糖基转移酶 Bacillus licheniformis 环糊精水解环化热稳定
分类号: TQ28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

环糊精葡萄糖基转移酶的学位论文">环糊精葡萄糖基转移酶(CGTases; EC 2.4.1.19)为食品工业中重要的酶,可利用淀粉作为底物生产以α-1,4糖苷键连接的环状低聚糖——环糊精；亦可用于生产具有新特性的低聚糖。利用碱耐受菌株Bacillus licheniformis SK13.002,研究了利用不同碳源,氮源和金属离子生产热稳定的β-CGTase。不同碳源中,当使用可溶性淀粉,以及来自玉米淀粉的麦芽糊精和糊精时,可以获得最高的CGTase酶活；在CGTase产量上,这几者无明显的差别。葡萄糖和麦芽糖对CGTase的生产具有代谢物阻遏作用。有机氮源大豆蛋白胨和酵母膏对CGTase的生产极为有利；而无机氮源则不适合CGTase的生产。金属离子中,MgS04和FeCl2对CGTase的生产最为有益。其中FeCl2对发酵产酶的影响尚未见报道；仅见研究报道了FeCl2对酶的稳定性的影响。发酵培养基中添加铁离子对CGTase合成有促进作用；ZnSO4, ZnCl2和CuSO4则对CGTase生产有抑制作用。B. licheniformis SK 13.002所产CGTase可显著水解淀粉生成线形糖,此外也有环糊精(CD)生成。CGTase的水解活性是环化活性的4倍。CGTase的副反应水解反应的加强在面包烘焙工业上可能会有有利的用途,但对于环糊精的生产会有不利的影响；因为水解产生的糖在偶联反应中加速环糊精环的降解,进而会限制最后的产量。B. licheniformis SK 13.002产CGTase所具有的水解活性可看作是由于在漫长进化过程中原始酶功能的一种部分保留。因此,此CGTase是处在进化中间阶段,介于“真正的”α-淀粉酶和“真正的”环糊精葡萄糖基转移酶之间的又一例证。CGTase在pH分别为7.0和6.0时,具有最高的环化和水解活性。环化和水解的最适温度都为65℃。CGTase在两种反应中都展示了高温活性,预示其在需要高温处理环节中的潜在应用。CGTase在65℃下30 min仍保留75%的环化酶活；65℃下处理1 h还可保留65%的环化酶活；在70℃下,CGTase才失去(环化)活力。在没有经过诸如不同浓度Ca2+、底物和其他试剂的优化的情况下,已可获得很高的CGTase热稳定性。B. licheniformis SK 13.002 CGTase的这种热稳定性使得其具有在CD工业化生产中的潜力,因为在蒸煮工序之后,CGTase起作用之前,淀粉溶液冷却程度可以降低——这将会降低生产成本：亦无必要用耐热α-淀粉酶对淀粉进行预处理。酶的这种热稳定特性也为蛋白质工程提供一个具优良遗传特性的模板,依靠此模板可以创造出具期望特性,而又高度稳定的酶。B. licheniformis SK 13.002β-CGTase以5%水解淀粉为底物所产CD以p-CD为主,γ-CD为辅；产物中无α-CD。在不添加任何物质,不进行生物转化条件优化的情况下,用粗酶液转化淀粉生产CD转化率最高可达50%。24 h酶反应之后,CD产物中β-CD占83%,γ-CD为17%。酶产物中β-和γ-CDs分别为20.9 g／1和4.2g／l。在CD的生产中,经济的转化率和无有毒络合剂生成在经济上非常重要。该酶的热稳定性以及产物中CD组成(β-和γ-CDs)的特性可引起人们的兴趣,因为通过CD溶解性的差异可以经济简单地分离纯化CD产物。因此,此酶在β-CD的工业化生产上极具潜力。利用阴离子交换层析和凝胶层析将B. licheniformis SK 13.002所产CGTase纯化至电泳纯。结果显示该酶包括两个同工酶,分子量分别为67.6 kDa和47.3 kDa。通过多步的纯化,酶的比酶活从粗酶液的0.49 U／mg增加到两个酶分别为9.46U／mg和8.83 U／mg,纯化倍数为37.3,得率为19.1%。B. licheniformis SK 13.002亦为可产生CGTase同工酶的菌株。

全文目录

ACKNOWLEDGEMENTS  4-5
DEDICATION  5-6
LIST OF FIGURES  6-7
LIST OF TABLES  7-8
LIST OF ABBREVIATIONS  8-9
ABSTRACT  9-11
摘要  11-13
TABLE OF CONTENTS  13-17
CHAPTER 1 INTRODUCTION AND LITERATURE REVIEW  17-32
  1.1. GENERAL INTRODUCTION:CYCLODEXTRIN GLYCOSYLTRANSFERASEENZYMES AND CYCLODEXTRIN PRODUCTION  17-18
  1.2. CYCLODEXTRIN GLYCOSYLTRANSFERASE ENZYMES  18-26
    1.2.1. Starch as a Substrate for CGTase Production  18-20
      1.2.1.1. Structure and Properties of Starch  18-19
      1.2.1.2. Starch processing enzymes  19-20
    1.2.2. Cyclodextrin Glycosyltransferase  20-26
      1.2.2.1. Substrate Binding and Catalytic Properties  21
      1.2.2.2. Three-Dimensional Structures  21-22
      1.2.2.3. Catalytic Mechanism and Evolution of Product Specificity  22-24
      1.2.2.4. Reaction Specificities  24-26
  1.3. CYCLODEXTRINS(CDS)  26-30
    1.3.1. Chemical Structure and Properties  27
    1.3.2. Solubility of CDs  27-28
    1.3.3. Use and Regulatory Status of CDs  28-29
    1.3.4. CD Production  29-30
  1.4. PROBLEM STATEMENT AND JUSTIFICATION OF RESEARCH  30-31
    1.4.1. Problem Statement  30
    1.4.2. Justification of Research  30-31
  1.5. MAIN OBJECTIVE  31-32
    1.5.1. Specific Objectives  31-32
CHAPTER 2 EFFECT OF MEDIA COMPOSITION ON PRODUCTION AND ACTIVITY OFCGTASE FROM BACILLUS LICHENIFORMIS SK 13.002 STRAIN AND ITSAPPLICATION FOR B-CYCLODEXTRIN PRODUCTION  32-57
  2.1. INTRODUCTION  32-34
  2.2. MATERIALS AND METHODS  34-38
    2.2.1. Materials  34
    2.2.2. Bacterial Strain Cultivation Conditions for CGTase Production  34-35
    2.2.3. Effect of Initial pH on CGTase Production  35
    2.2.4. Effects of Media Composition on CGTase Production  35
    2.2.5. Time Course Production of CGTase  35
    2.2.6. CGTase Activity Assays  35-37
      2.2.6.1. Making of a β-CD Calibration Curve  35-36
      2.2.6.2. Cyclization Activity  36-37
      2.2.6.3. Hydrolysis Activity  37
      2.2.6.4. CGTase Activities as a Function of Temperature and pH  37
    2.2.7. CGTase Thermal Stability  37
    2.2.8. Analysis of CGTase CD Production by HPLC  37-38
    2.2.9. Statistical Analysis  38
  2.3. RESULTS AND DISCUSSION  38-54
    2.3.1. Bacterial Strain Growth and Effect of Initial pH on CGTase Production  38-39
    2.3.2. Effect of Carbon Sources on CGTase Production  39-41
    2.3.3. Effect of Nitrogen Sources on CGTase Production  41-42
    2.3.4. Effect of Metal Ions on CGTase Production  42-44
    2.3.5. Time Course Production of CGTase  44-47
    2.3.6. Effect of pH on Cyclization and Hydrolysis Activities  47-48
    2.3.7. Effect of Temperature on Cyclization and Hydrolysis Activities  48-49
    2.3.8. CGTase Thermal Stability  49-52
    2.3.9. Production of CDs  52-54
  2.4. CONCLUSIONS  54-57
CHAPTER 3 PURIFICATION OF BACILLUS LICHENIFORMIS SK 13.002 CGTASEISOENZYMES  57-63
  3.1. INTRODUCTION  57
  3.2. MATERIALS AND METHODS  57-59
    3.2.1. Materials  57
    3.2.2. CGTase Concentration and Precipitation  57-58
    3.2.3. Purification of CGTase  58
      3.2.3.1. DEAE-Sepharose Ion-Exchange Chromatography  58
      3.2.3.2. Superdex-75 Gel Filtration Chromatography  58
    3.2.4. Molecular Weight and Protein Quantification  58-59
  3.3. RESULTS AND DISCUSSION  59-62
    3.3.1. Concentration and Purification of CGTase  59-61
    3.3.2. Homogeneity and Molecular Weights of CGTase Isozymes  61-62
  3.4. CONCLUSIONS  62-63
4. GENERAL CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS  63-66
  4.1. GENERAL CONCLUSIONS  63-65
  4.2. RECOMMENDATIONS  65-66
5. LIST OF PUBLICATIONS  66-67
6. REFERENCES  67-77

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