β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是一种无毒无副作用的生物酶制剂,既能水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖,解决在约占世界十分之一的人群中存在的乳糖不耐症问题；还能催化转移半乳糖苷反应,制备功能性低聚半乳糖和具有临床治疗功能的乳果糖。本实验室分离得到一株" />

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节杆菌产β-半乳糖苷酶分离纯化及动力学参数分析

作　者: 李珍爱
导　师: 唐蕾
学　校: 江南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 节杆菌 β-半乳糖苷酶分离纯化酶学性质乳糖乳果糖
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

乳糖苷酶的学位论文">β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是一种无毒无副作用的生物酶制剂,既能水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖,解决在约占世界十分之一的人群中存在的乳糖不耐症问题；还能催化转移半乳糖苷反应,制备功能性低聚半乳糖和具有临床治疗功能的乳果糖。本实验室分离得到一株产p-半乳糖苷酶的节杆菌,该p-半乳糖苷酶同时具有水解与转苷活性,本研究以分离纯化该酶并研究其酶学性质为目的。以乳糖发酵培养基培养节杆菌,离心收集菌体,超声破碎细胞得到粗酶液；采用硫酸铵沉淀、Phenyl-Sepharose疏水、DEAE-Sepharose离子交换和p-aminobenzyl-l-thio-β-D-galactopyranoside(PABTG)亲和层析方法进行酶的分离纯化,纯化倍数达到31.4,经SDS-PAGE检测分子量为30kD。以邻硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(ONPG)为底物,研究纯化后p-半乳糖苷酶的酶学性质,结果表明：该酶最适pH值为6.6,最适反应温度为37℃,pH在6.0-8.0范围内稳定性较好,相对酶活均在80%以上,温度低于30℃时,相对酶活在1h内保持在50%以上。Mg2+、Mn2+、Co2+、K+对酶有显著的激活作用,Cu2+、Ag+则有明显的抑制作用。添加金属离子可以提高酶的热稳定性,尤其是1 mmol/L的Mn2+,使酶在45℃时保持60 mmin酶活几乎没有损失。以ONPG为底物时测得β-半乳糖苷酶的米氏常数为4.64mmol/L,最大反应速率为0.919μmol/min。以乳糖为底物,研究纯化后p-半乳糖苷酶的水解能力,并通过高效液相色谱法(HPLC)分析产物中葡萄糖的含量,结果显示水解乳糖的最适条件：乳糖浓度为3%,反应温度为30℃,反应时间为6-8h,pH在6.5-7.0时反应速率达到最大。本文还研究了p-半乳糖苷酶的转半乳糖苷性质,以果糖为转苷受体,采用高效液相色谱法测定酶反应产物中乳果糖的含量,进而分析该酶的转苷活性,结果表明：转苷的最适温度为20℃,最适pH为6.0。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章绪论  7-15
  1.1 研究背景  7-13
    1.1.1 乳糖苷酶的学位论文">β-半乳糖苷酶  7
    1.1.2 β-半乳糖苷酶的来源  7
    1.1.3 β-半乳糖苷酶的结构与性质  7-10
    1.1.4 β-半乳糖苷酶的分离与纯化  10-11
    1.1.5 β-半乳糖苷酶的应用  11-12
    1.1.6 β-半乳糖苷酶的固定化  12-13
  1.2 β-半乳糖苷酶国内外研究进展  13
  1.3 研究意义  13-14
  1.4 本论文研究的主要内容  14-15
第二章材料与方法  15-21
  2.1 实验材料  15-16
    2.1.1 菌株  15
    2.1.2 培养基  15
    2.1.3 试剂  15
    2.1.4 主要仪器  15-16
  2.2 实验方法  16-21
    2.2.1 菌体培养  16
    2.2.2 酶液制备  16
    2.2.3 超声波破壁条件优化  16-17
    2.2.4 酶活测定方法  17
    2.2.5 蛋白含量测定方法  17
    2.2.6 酶的分离纯化  17-18
    2.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  18
    2.2.8 对ONPG的水解活性  18
    2.2.9 对乳糖的水解活性  18-19
    2.2.10 转半乳糖苷活性  19-21
第三章结果与讨论  21-37
  3.1 超声波破壁对β-半乳糖苷酶提取的影响  21-22
    3.1.1 超声时间对酶提取的影响  21
    3.1.2 超声功率对酶提取的影响  21-22
    3.1.3 固液比对酶提取的影响  22
  3.2 酶的分离纯化  22-25
    3.2.1 硫酸铵饱和度的确定  22-23
    3.2.2 Phenyl-Sepharose疏水层析  23
    3.2.3 DEAE-Sepharose离子交换层析  23-24
    3.2.4 PABTG亲和层析  24
    3.2.5 β-半乳糖苷酶纯化结果分析  24-25
  3.3 β-半乳糖苷酶的水解活性  25-35
    3.3.1 对ONPG的水解活性  26-33
    3.3.2 对乳糖的水解活性  33-35
  3.4 转半乳糖苷活性  35-37
    3.4.1 pH对转半乳糖苷活性的影响  35-36
    3.4.2 温度对转半乳糖苷活性的影响  36-37
第四章结论  37-38
致谢  38-39
参考文献  39-43
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  43

节杆菌产β-半乳糖苷酶分离纯化及动力学参数分析

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