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反硝化菌DNF409水体脱氮规律研究及其narG基因的中断

作　者: 张小玲
导　师: 梁运祥
学　校: 华中农业大学
专　业: 发酵工程
关键词: 反硝化芽孢杆菌硝酸盐还原酶基因中断 narG基因
分类号: X714
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 207次
引　用: 6次
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内容摘要

养殖水环境的日趋恶化已成为制约我国水产养殖业发展的重要因素，其中亚硝酸盐污染已成为水产养殖业常见且难以预防的危害因素之一。生物反硝化法是理论上解决水体氮污染的有效方法。本研究的目的是通过系统研究反硝化菌DNF409的反硝化特性及在天然养殖水体中的脱氮规律，获得用以指导其实际应用的各项参数；并采用基因打靶技术中断该菌株硝酸盐还原酶的结构基因narG基因，以改善其反硝化特性。具体研究结果如下： 1．通过生理生化和16S rDNA序列分析，反硝化菌DNF409初步判断为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。生长的最适pH为6～7，反硝化作用的最适pH为7～8。在生长的各个阶段，菌株DNF409均具有较强的反硝化活性，最佳反硝化碳源为乙醇。 2．菌株DNF409可在天然养殖水体中高效进行反硝化作用。研究表明，28℃～30℃，当水体C／N(质量比)大于等于8.0∶1，菌体浓度达到10~8cfu／L时，硝态氮和亚硝态氮的降解率可分别达到94.79％和99.94％。表明该菌株在养殖水体的生物脱氮方面具有广阔的应用前景。 3．利用E.coli与Bacillus sp.的穿梭质粒pEG491，构建了narG基因中断载体pEGude。该质粒带有一个温度敏感型的复制子，并携带有两个长度分别为1.1Kb、2.1Kb且与narG基因序列方向完全相同的同源臂，在同源臂之间及载体部分别含有可在菌株DNF409中表达的抗性基因erm、cat。 4．将基因中断载体pEGude电激转化至反硝化菌DNF409中，通过抗性筛选得到表型为Erm~r Cm~s的重组子DNF409EF，并通过PCR分析证实narG基因已被正确中断。 5．对基因中断菌株DNF409EF进行反硝化能力检测，结果表明该菌株并未失去对硝酸盐的还原能力。但它对硝酸盐及亚硝酸盐的还原作用与菌株DNF409相比，均出现了一定程度的延后现象，初步说明硝酸盐的异化还原对亚硝酸盐的异化还原存在一定的影响。该实验结果与预期结果不符，具体原因有待进一步研究探明。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-8
缩略名词表(ABBREVIATIONS)  8-9
1.前言  9-26
  1.1 研究背景  9-10
  1.2 水体中的氮素来源及危害  10-12
    1.2.1 水体中氮的来源  10-11
    1.2.2 氮污染的主要危害  11-12
  1.3 水体氮污染的治理  12
  1.4 生物脱氮的原理  12-22
    1.4.1 传统生物脱氮的基本原理  12-17
      1.4.1.1 同化作用  13
      1.4.1.2 氨化作用  13
      1.4.1.3 硝化作用  13-15
      1.4.1.4 反硝化作用  15-17
    1.4.2 新型生物脱氮理论  17-22
      1.4.2.1 异养硝化一好氧反硝化生物脱氮  17-19
      1.4.2.2 厌氧氨氧化  19-21
      1.4.2.3 自养反硝化菌的反硝化生物脱氮  21
      1.4.2.4 自养硝化菌的反硝化生物脱氮  21-22
  1.5 反硝化酶系  22-25
    1.5.1 硝酸盐还原酶(Nar)  22-23
    1.5.2 亚硝酸盐还原酶(Nir)  23-24
    1.5.3 一氧化氮还原酶(Nor)  24
    1.5.4 一氧化二氮还原酶(Nos)  24-25
  1.6 课题的立题依据、目的及意义  25-26
2.实验材料和方法  26-35
  2.1 实验材料  26-29
    2.1.1 菌株和质粒  26-27
    2.1.2 工具酶  27
    2.1.3 试剂  27-28
    2.1.4 培养基  28-29
    2.1.5 主要仪器设备  29
  2.2 实验方法  29-35
    2.2.1 反硝化菌DNF409特性研究  29-31
      2.2.1.1 菌株反硝化活性检测  29
      2.2.1.2 最适生长及反硝化作用pH试验  29-30
      2.2.1.3 反硝化碳源试验  30
      2.2.1.4 在天然养殖水体中的反硝化特性  30-31
      2.2.1.5 水质指标的分析方法  31
    2.2.2 反硝化菌DNF409 narG基因中断研究  31-35
      2.2.2.1 大肠杆菌质粒DNA的提取  31
      2.2.2.2 苏云金芽胞杆菌质粒的制备  31
      2.2.2.3 芽胞杆菌总DNA的抽提  31-32
      2.2.2.4 DNA的电泳分析  32
      2.2.2.5 DNA片段的回收  32
      2.2.2.6 大肠杆菌的常规转化  32
      2.2.2.7 芽胞杆菌的电转化  32
      2.2.2.8 反硝化菌DNF409的种属鉴定  32-33
      2.2.2.9 PCR引物  33-34
      2.2.2.10 PCR扩增  34-35
3.结果与分析  35-52
  3.1 反硝化菌DNF409特性研究  35-40
    3.1.1 菌株DNF409生长及反硝化曲线  35
    3.1.2 反硝化碳源试验  35-36
    3.1.3 最适生长及反硝化作用pH  36-37
    3.1.4 菌株DNF409在天然养殖水体中的反硝化特性  37-40
      3.1.4.1 在天然养殖水体中的反硝化活性  37-39
      3.1.4.2 碳氮比对反硝化作用的影响  39
      3.1.4.3 投菌浓度试验  39-40
  3.2 反硝化菌DNF409 narG基因中断的研究  40-52
    3.2.1 基因中断的原理  40-41
    3.2.2 反硝化菌DNF409的种属鉴定  41
    3.2.3 反硝化菌DNF409 narG部分基因序列的扩增及测序  41
    3.2.4 narG短臂S及长臂L的扩增  41-42
    3.2.5 基因中断载体pEGude的构建  42-45
    3.3.6 基因中断载体的转化及双交换菌株的筛选  45-46
    3.3.7 narG基因中断的验证  46-49
      3.3.7.1 重组子质粒图谱分析  46-47
      3.3.7.2 重组子PCR验证  47-49
    3.3.8 narG基因中断菌株反硝化能力检测  49-52
      3.3.8.1 在富含硝酸盐的养殖水体中的反硝化作用  49-50
      3.3.8.2 在富含亚硝酸盐的养殖水体中的反硝化作用  50-52
4.总结与讨论  52-55
  4.1 总结  52
  4.2 讨论  52-54
  4.3 展望  54-55
参考文献  55-60
致谢  60-61
附录  61

反硝化菌DNF409水体脱氮规律研究及其narG基因的中断

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