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阴道毛滴虫沉寂信息调节因子Sir2和Sir2-like及半乳糖苷酶β-Gal基因克隆、表达及细胞内定位

作　者: 史咏梅
导　师: 傅玉才
学　校: 汕头大学
专　业: 免疫学
关键词: 阴道毛滴虫衰老 TvSIR2 TvSIR2-like Tvβ-GAL
分类号: R383
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

研究目的 (1)克隆原生动物阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)沉寂信息调节因子2(Silent information regulator 2，SIR2)同源基因：TvSIR2。构建TvSIR2和TvSIR2-like(我室克隆)基因原核表达重组载体并表达其融合蛋白，制备抗体，Western blotting鉴定后免疫荧光法进行细胞定位。(2)克隆阴道毛滴虫β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-GAL)同源基因：Tvβ-GAL。构建Tvβ-GAL原核表达载体并表达融合蛋白。材料和方法(1)从阴道毛滴虫cDNA表达文库中克隆出SIR2的同源基因并进行保守结构域同源性分析。将部分TvSIR2和TvSIR2-like cDNA片段克隆入表达载体pET-41，转化大肠杆菌BL21，在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-B-D-galactoside，IPTG)诱导下表达目的基因融合蛋白，Ni-NTA亲和层析纯化表达产物，SDS-PAGE鉴定表达产物的分子量和纯化的表达产物。用纯化的融合蛋白免疫豚鼠，获得抗血清，Western blotting对抗体特异性分析鉴定后用免疫荧光法进行阴道毛滴虫细胞内定位。(2)从阴道毛滴虫cDNA表达文库中克隆出β-GAL的同源基因并进行保守结构域同源性分析。将部分cDNA片段克隆入表达载体pQE-80L，转化大肠杆菌SG13009，在IPTG诱导下表达目的基因融合蛋白。结果(1)从阴道毛滴虫cDNA表达文库中成功分离到沉寂信息调节因子SIR2同源基因TvSIR2。克隆到的TvSIR2 cDNA长1034对碱基，包括开放阅读框架915对碱基，推测编码蛋白序列含有304个氨基酸，等电点为5.5。序列分析表明它与Sir2p及其同源蛋白有较高的同源性，其中与家蚕(Bombyx mori)的Sir2p同：源性最高，在307个氨基酸的保守序列区，一致性和相似性达到47％和64％。其次是人，在301个氨基酸中一致性和相似性分别为43％和60％。与酵母的Sir2p相比，在241个保守氨基酸序列中一致性和相似性分别为41％和55％。与线虫在240个氨基酸保守序列中一致性和相似形分别为39％和61％。与果蝇的的Sir2p蛋白质一致性和相似性在256个氨基酸中分别为38％和54％。与我室分离到的另一个TvSir2-like蛋白一致性和相似性在277个氨基酸中分别为

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
前言  9-11
实验材料和仪器  11-13
第一部分 TvSIR2和TvSIR2-like基因克隆和蛋白表达及细胞定位  13-32
  实验方法  13-22
    TvSIR2序列分析  13
    TvSIR2及TvSIR2-like cDNA原核表达  13-20
    TvSIR2及TvSIR2-like Western blotting检测及细胞内定位  20-22
  实验结果  22-32
第二部分阴道毛滴虫半乳糖苷酶β-Gal同原基因克隆和表达  32-41
  实验方法  32-35
    Tvβ-GAL序列分析  32
    Tvβ-GAL cDNA原核表达  32-35
  实验结果  35-41
讨论  41-46
结论  46-47
参考文献  47-51
综述  51-59
附录1 英文缩略词表  59-60
附录2 试剂配制  60-63
致谢  63

阴道毛滴虫沉寂信息调节因子Sir2和Sir2-like及半乳糖苷酶β-Gal基因克隆、表达及细胞内定位

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