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去糖基化对蚯蚓纤溶酶部分生物学性质的影响

作　者: 殷鹏
导　师: 武金霞
学　校: 河北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 蚯蚓纤溶酶 糖蛋白 三氟甲基磺酸 糖苷酶A
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 25次
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内容摘要


以大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI为配基,Sepharose-4B为载体的亲和层析从赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)匀浆液中分离出了蚯蚓纤溶酶全组分,采用DEAE-Cellulose-52禺子交换柱层析和制备电泳分离纯化了蚯蚓纤溶酶单组分EfP-I-1和EfP-I-2。纤维蛋白平板法和BAEE测得组分EfP-I-1的比活力分别为0.30 IU/μg和3.79 U/μg,组分EfP-I-2的比活力分别为0.41 IU/μg和6.13 U/μg。Schiffs试剂染色证明蚯蚓纤溶酶为一组糖蛋白组分,全组分的含糖量为2.98%,单组分EfP-I-1和EfP-I-2含糖量分别为5.71%和1.93%。三种凝集素ConA,LCA,AAL点印迹结果表明,EIP-I-1和EfP-I-2都具有末端甘露糖残基和核心岩藻糖结构的糖形。分别以三氟甲基磺酸去糖基化前后的蚯蚓纤溶酶全组分EFEs为抗原免疫家兔,Western-blotting和ELISA结果表明,两种抗原的免疫原性和免疫反应性没有明显的差别。单组分EfP-I-1和EfP-I-2经三氟甲基磺酸去糖基化后失去了抵抗胰蛋白酶水解的能力,而蚯蚓纤溶酶全组分经去糖基化后完全丧失了纤溶活性。以糖苷酶A对固定在Sepharose-4B-SBTI上的蚯蚓纤溶酶进行去糖链处理,ConA-HRP亲和印迹和Schiff’s染色结果表明,蚯蚓纤溶酶的糖链被去除,纤维蛋白平板法检测去除糖链后纤溶酶活性降低大约30%。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
第1章 前言  10-18
  1.1 蚯蚓纤溶酶简介  10-11
    1.1.1 蚯蚓简介  10
    1.1.2 蚯蚓纤溶酶简介  10
    1.1.3 蚯蚓纤溶酶研究历史与现状  10-11
  1.2 糖蛋白简介  11-16
    1.2.1 糖蛋白简介  11-12
    1.2.2 糖链在糖蛋白中的重要作用  12-13
    1.2.3 糖链的研究意义  13-14
    1.2.4 糖蛋白研究方法  14-16
  1.3 本实验室前期相关工作  16
  1.4 本实验研究意义及主要内容  16-18
第2章 蚯蚓纤溶酶全组分分离及单组分纯化  18-25
  2.1 材料与方法  18-20
    2.1.1 材料  18
    2.1.2 试剂  18
    2.1.3 仪器  18
    2.1.4 方法  18-20
  2.2 结果与讨论  20-24
    2.2.1 蚯蚓纤溶酶全组分的分离  20-22
    2.2.2 蚯蚓纤溶酶单组分的纯化  22-23
    2.2.3 蚯蚓纤溶酶组分的活性测定  23-24
  2.3 小结  24-25
第3章 蚯蚓纤溶酶糖链性质的初步鉴定  25-32
  3.1 材料与方法  25-27
    3.1.1 材料  25
    3.1.2 试剂  25
    3.1.3 仪器  25
    3.1.4 方法  25-27
  3.2 结果与讨论  27-31
    3.2.1 Schiff's染色鉴定蚯蚓纤溶酶的糖蛋白  27-28
    3.2.2 硫酸苯酚法测蚯蚓纤溶酶的糖含量  28-29
    3.2.3 凝集素法分析蚯蚓纤溶酶糖链糖形  29-31
  3.3 小结  31-32
第4章 TFMS去糖基化对蚯蚓纤溶酶性质的影响  32-46
  4.1 材料与方法  32-35
    4.1.1 材料  32
    4.1.2 试剂  32
    4.1.3 仪器  32-33
    4.1.4 方法  33-35
  4.2 结果与讨论  35-44
    4.2.1 TFMS去除糖链效果的检测  35-36
    4.2.2 蚯蚓纤溶酶去糖基化前后的免疫原性  36-38
    4.2.3 蚯蚓纤溶酶去糖基化前后的免疫反应性  38-42
    4.2.4 去糖基化前后EfP-I-1,EfP-I-2对胰蛋白酶的抗性  42-44
    4.2.5 TFMS去除糖链后蚯蚓纤溶酶活性变化  44
  4.3 小结  44-46
第5章 糖苷酶去糖基化对蚯蚓纤溶酶活性的影响  46-51
  5.1 材料与方法  46-47
    5.1.1 材料  46
    5.1.2 试剂  46
    5.1.3 仪器  46
    5.1.4 方法  46-47
  5.2 结果与讨论  47-50
    5.2.1 糖苷酶A对固定EFEs的去糖基化  47-49
    5.2.2 蚯蚓纤溶酶经糖苷酶A去糖链后的酶活变化  49-50
  5.3 小结  50-51
第6章 结论  51-52
参考文献  52-57
致谢  57-58
硕士期间发表论文情况  58

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 酶
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