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猪瘟病毒主要抗原基因与猪IL2重组腺病毒的构建及鉴定

作　者: 谢磊
导　师: 王在时；赵耘
学　校: 中国兽医药品监察所
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪瘟病毒 pIRES 重组腺病毒 同源重组 293A
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


本研究将猪瘟病毒主要抗原基因、非结构蛋白基因和猪源细胞因子插入腺病毒表达载体系统中，构建成多组重组腺病毒，为猪瘟病毒活载体疫苗的研究奠定基础。 以猪瘟病毒石门毒（F119代）和猪外周血淋巴细胞为材料，根据GeneBank数据库中已发表基因序列设计特异性引物，采用RT-PCR方法将完整猪瘟病毒主要抗原基因E0、E2和非结构蛋白基因NS2.3以及猪源细胞因子IL2依次克隆入pIRES载体MCSA和MCS B中，经酶切、PCR及测序鉴定，获得可用于构建腺病毒载体的单基因、双基因和三基因oIRES质粒。将重组pIRES质粒中目的基因片段亚克隆入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV（pSC）中，构建了多组重组腺病毒穿梭质粒， 将含有猪瘟病毒E2基因的穿梭质粒电转入含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183中进行细菌内同源重组，得到6种重组腺病毒质粒：pAd-E2、pAd-IL2、pAd-E2IL2、pAd-E2E2、pAd-E2E2IL2和pAd-C。应用脂质体转染技术将线性化的阳性重组腺病毒质粒转导入293A细胞中得到重组腺病毒：tAd-E2、rAd-IL2、rAd-E2E2、rAd-E2IL2和rAd-E2E2IL2和rAd-C。接种该6株重组腺病毒的293A细胞于37℃ CO2培养箱培养7～10天，细胞产生圆缩、聚簇成葡萄状、脱落等细胞病变；RT-PCR鉴定结果表明外源基因E2和IL2均正确插入，且随腺病毒基因组一起进行转录；SDS-PAGE和Western-Blot检测可知外源猪瘟E2蛋白得到正确表达，具有反应原性，猪源IL2定量ELISA试剂盒检测表明二代重组腺病毒样品rAd-IL2、rAd-E2IL2、rAd-E2E2IL2的IL2基因均得到正确表达，且浓度分别为148.4、120.4、114.2pg／ml：在293A细胞上连续传代3次后再测定组织细胞半数感染量，重组腺病毒效价稳定；五种重组腺病毒质粒的滴度(TCID50／ml)分别为：106.76（rAd-E2）、104.36（rAd-IL2）、104.56（rAd-E2IL2）、103.70（rAd-E2E2）、104.16（rAd-E2E2IL2）；猪瘟重组腺病毒的获得为猪瘟病毒活载体疫苗的开发奠定基础，同时为建立疫苗配套ELISA检测方法创造了条件。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-6
列表清单  6-7
插图清单  7-8
缩略词表  8-10
第一章 文献综述  10-24
  1.1 国内外研究概况  10-22
  1.2 研究目的与意义  22-24
第二章 猪瘟病毒EO、E2、NS2.3基因与猪源IL2多组合基因重组腺病毒穿梭质粒的构建  24-48
  2.1 前言  24-25
  2.2 材料与方法  25-34
  2.3 结果与分析  34-46
  2.4 讨论  46-47
  2.5 小结  47-48
第三章 猪瘟病毒重组腺病毒的构建及生物学鉴定  48-73
  3.1 前言  48-49
  3.2 材料与方法  49-56
  3.3 结果与分析  56-69
  3.4 讨论  69-72
  3.5 小结  72-73
第四章 结束语  73-75
  4.1 实验结论  73-74
  4.2 对实验下一步的设想  74-75
参考文献  75-80
附录  80-86
  附录一 试验所用溶液及其配制  80-85
  附录二 主要仪器和设备  85-86
作者简历  86-87
致谢  87

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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