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抗汞载体的构建及在喜温硫杆菌中的表达

作　者: 陈丹丹
导　师: 林建强；林建群
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 生物冶金喜温硫杆菌抗汞基因工程菌
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 102次
引　用: 2次
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内容摘要

喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)是1994年分离出来的新菌种，为一种专性自养的极端嗜酸性硫杆菌，它广泛分布于硫化矿床、酸性矿水及土壤中，在细菌冶金、煤的脱硫和含硫废水的处理等方面发挥着重要作用，同时在自然界的硫循环中也占有重要地位。但是在实际应用过程中，因该菌具有生长缓慢、细胞得率低及对重金属如砷、汞、银等缺乏抗性等弱点，不仅限制了其应用范围，而且也给实验室的研究工作带来许多不便。要想充分发挥生物冶金的功能，对喜温硫杆菌进行遗传改造势在必行。本实验将来自于嗜酸性氧化亚铁硫杆菌中的抗汞基因与具有广泛寄主的IncQ类群载体质粒pJRD215连接，构建了组成型及可调控型的抗汞质粒载体pTMJ212、pTMJ213，将其转入E．coli SM10中，并对E．coli SM10抗汞特性的表达进行了检测，结果表明携带有质粒pTMJ212、pTMJ213的E．coli SM10对汞的MIC(最大抑制浓度)分别由5μg／ml提高至22.5μg／ml、12.5μg／ml。通过接合转移将所构建的抗汞质粒pTMJ212转入喜温硫杆菌中，经由IncQ类群的RP4质粒的带动，以E．coli C600(RP4)为受体菌进行反向接合实验，筛选接合转移子，提取质粒电泳检测，结果与来自于E．coli SM10中的抗汞质粒pTMJ212一致，从而证实抗汞质粒成功转入了喜温硫杆菌中。通过对所构建的喜温硫杆菌基因工程菌的最大生长量、生长曲线、细胞总蛋白含量的测定，证明其抗汞特性较野生型得到了明显的提高，其MIC由野生型的2.5μg／ml提高至4.5μg／ml。在无选择压力条件下将其连续传带50代，抗汞质粒可保留75％以上，从而证实抗汞质粒能在喜温硫杆菌中稳定表达。本实验成功地构建了能在E．coli与硫杆菌之间进行接合转移的抗汞质粒载体，并将其转移入喜温硫杆菌中，构建了能对含汞金矿进行生物浸出的生产菌株，同时为改造其它浸矿细菌，提高铁、硫氧化细菌的抗汞能力提供了合适、高效的抗汞载体。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
缩略语  9-10
第一章绪论  10-25
  1.1.细菌抗汞特性研究现状  10-14
    1.1.1 细菌抗汞特性研究现状  10-11
    1.1.2 细菌抗汞机理  11-14
      1.1.2.1 细菌抗汞所涉及的基因结构元件  11-12
      1.1.2.2 细菌抗汞过程中汞的转运与降解  12-14
  1.2 生物冶金技术  14-17
    1.2.1 生物冶金技术简介  14-16
    1.2.2 生物治金中的浸矿微生物  16-17
  1.3 喜温硫杆菌的研究进展  17-24
    1.3.1 喜温硫杆菌的分离及其特性  17-18
    1.3.2 喜温硫杆菌在浸矿过程中的作用机制  18-20
    1.3.3 喜温硫杆菌基因方面的研究  20-21
    1.3.4 喜温硫杆菌遗传系统及遗传改造方面的研究  21-24
  1.4 本论文的研究意义及内容  24-25
第二章抗汞质粒载体的构建  25-38
  2.1 引言  25-26
  2.2 材料与方法  26-29
    2.2.1 菌株与质粒  26
    2.2.2 培养基和培养条件  26
      2.2.2.1 LB培养基  26
      2.2.2.2 麦康凯培养基  26
    2.2.3.抗生素使用浓度  26-27
    2.2.4.DNA操作技术  27-29
      2.2.4.1 质粒DNA的提取  27
      2.2.4.2琼脂糖凝胶电泳  27
      2.2.4.3 DNA浓度、纯度和DNA分子量的测定  27-28
      2.2.4.4 限制性核酸内切酶酶切  28
      2.2.4.5 琼脂糖凝胶中DNA片段的回收  28
      2.2.4.6 连接  28
      2.2.4.7 质粒DNA的转化  28-29
      2.2.4.8 PCR技术  29
    2.2.5 菌种保藏  29
  2.2 实验结果  29-38
    2.2.1 组成型抗汞质粒载体pTMJ212的构建  29-32
    2.2.2 可调节型抗汞质粒载体pTMJ213的构建  32-35
      2.2.2.1 merRTPA基因的克隆  32-33
      2.2.2.2 可调节型抗汞质粒载体pTMJ213的构建  33-35
    2.2.3 重组质粒pTMJ213与pTMJ212的抗汞基因在大肠杆菌中的表达  35-38
第三章抗汞质粒在喜温硫杆菌中的表达研究  38-51
  3.1 引言  38-39
  3.2.材料和方法  39-44
    3.2.1 菌株和质粒  39
    3.2.2 培养基和培养条件  39-40
      3.2.2.1 大肠杆菌  39
      3.2.2.2 喜温硫杆菌  39-40
      3.2.2.3 大肠杆菌—氧化硫硫杆菌接合培养基及菌体洗涤液  40
    3.2.3 抗生素使用浓度  40
    3.2.4 大肠杆菌和喜温硫杆菌的接合转移  40-41
      3.2.4.1 供体菌及受体菌的准备  40
      3.2.4.2 大肠杆菌与喜温硫杆菌的接合  40-41
      3.2.4.3 接合转移子的鉴定  41
      3.2.4.4提取质粒鉴定  41
      3.2.2.5反向接合转移  41
    3.2.5 质粒稳定性测定  41
    3.2.6 DNA操作技术  41-42
      3.2.6.1 质粒DNA的提取  41-42
      3.2.6.2 琼脂糖凝胶电泳  42
      3.2.6.3 限制性核酸内切酶酶切  42
      3.2.6.4 质粒DNA的转化  42
    3.2.7 细胞总蛋白含量测定  42-43
      3.2.7.1 标准曲线的绘制  42-43
      3.2.7.2 细胞总蛋白含量测定(考马斯亮蓝染色法)  43
    3.2.8 重组菌抗汞性能检测  43-44
    3.2.9 菌种保藏  44
      3.2.9.1 大肠杆菌的保藏  44
      3.2.9.2 喜温硫杆菌的保藏  44
  3.3 实验结果  44-49
    3.3.1 抗汞质粒pTMJ212从大肠杆菌到喜温硫杆菌中的接合转移  44-45
    3.3.2 抗汞质粒pTMJ212从喜温硫杆菌向大肠杆菌的反向接合  45-46
    3.3.3 抗汞质粒pTMJ212在喜温硫杆菌中稳定性测定  46
    3.3.4 抗汞质粒pTMJ212在喜温硫杆菌中的表达及抗汞能力测定  46-49
  3.4 讨论  49-51
参考文献  51-57
致谢  57-58
攻读学位期间发表论文目录  58-59
学位论文评阅及答辩情况表  59

抗汞载体的构建及在喜温硫杆菌中的表达

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