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杨树组培和欧美杨108无性系几丁质酶基因转化研究

作　者: 熊忠平
导　师: 王志英
学　校: 东北林业大学
专　业: 森林保护学
关键词: 欧美杨108无性系几丁质酶基因基因转化农杆菌转基因植株
分类号: S792.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

杨树具有重要的生产和生态价值,在国民经济中发挥着巨大作用,由于长期遭受病虫害的侵害,造成严重的经济损失,人们为此采取了各种措施来减少危害。基因工程技术的发展,将抗性基因转化到杨树基因组中,提高杨树抗病虫害能力,为病虫害的控制提供了一条新途径。本研究建立了三种新品系杨树欧美杨108无性系（Populus×euramericana cv.‘guariento’）、山西杨×新疆杨（P.pyramidalis spp.×P.alba var.pyramidalis）、美州杨×海拉尔杨（P.deltoids×P.pyramidalis sp.）的组培系统,得到了适合的培养基和激素配比:生根培养基为:WPM+IBA 0.4mg/L+20g/L蔗糖+5.6g/L琼脂（pH5.6）;分化培养基为:MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.1mg/L+20g/L蔗糖+5.6g/L（pH5.6）;对pH值、琼脂浓度、温度、湿度等其他影响因素也做了分析比较试验,建立了高频再生体系,对杨树基因转化和遗传育种具有重要的理论和实践意义。利用CaCl₂冻融法,构建了EHA105表达载体,经平板抗性压筛选,选择出抗性菌落,提取了抗性菌落质粒DNA,进行PCR扩增,结果证明携带目的基因的质粒转化成功。为欧美杨108无性系建立了农杆菌叶盘介导遗传转化体系:叶片预培养2～3d后,用OD₆₀₀=0.3～0.5的工程菌液进行侵染,侵染时间20min,之后置暗处共培养2～4d,再转入含30mg/L卡那霉素和800mg/L头孢噻肟钠的选择培养基上进行选择培养,经选择培养得到的抗性芽转入含卡那霉素20mg/L,头孢噻肟钠800mg/L生根培养基上进行生根培养,获得抗性植株。本研究共侵染了166皿3320个叶片,获得卡那霉素抗性芽和抗性植株,对抗性植株DNA进行PCR扩增检测,4株呈阳性,转化率为0.12%。对阳性植株PCR-Southern杂交检测,证明目的基因已整合到杨树基因组中。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
1 绪论  8-26
  1.1 引言  8
  1.2 杨树的组织培养  8-9
  1.3 杨树基因组学研究  9-10
    1.3.1 杨树遗传连锁图谱的建立  9-10
    1.3.2 杨树有关基因的克隆  10
  1.4 杨树转基因研究  10-12
    1.4.1 抗虫转基因研究  10-11
    1.4.2 抗病转基因研究  11-12
  1.5 杨树遗传转化方法  12-13
    1.5.1 农杆菌介导法  12
    1.5.2 基因枪法  12-13
    1.5.3 其他转化方法  13
    1.5.4 影响杨树遗传转化效率的因素  13
    1.5.5 转化子标记抗性筛选  13
  1.6 几丁质酶基因研究  13-18
    1.6.1 几丁质  13-14
    1.6.2 几丁质的分布  14
    1.6.3 几丁质酶  14-15
    1.6.4 微生物几丁质酶  15-16
    1.6.5 植物几丁质酶  16-18
  1.7 几丁质酶及其基因在植物病虫害防治中的应用  18-22
    1.7.1 在植物病害防治中的应用  18-20
    1.7.2 在植物虫害防治中的应用  20-22
    1.7.3 几丁质酶与植物的防卫反应机制  22
  1.8 植物转几丁质酶基因工程的研究  22-23
    1.8.1 几丁质酶基因克隆  22-23
    1.8.2 己转几丁质酶基因的植物  23
  1.9 杨树基因工程中存在的问题  23-24
  1.10 研究的意义  24-26
2 材料与方法  26-36
  2.1 材料  26-28
    2.1.1 组培杨树  26
    2.1.2 工程菌  26
    2.1.3 主要仪器设备  26-27
    2.1.4 试验试剂  27-28
  2.2 方法  28-32
    2.2.1 外植体的选择和消毒  28-29
    2.2.2 最佳培养基的确立  29
    2.2.3 抗生素敏感性试验  29
    2.2.4 碱法提取少量质粒 DNA  29
    2.2.5 农杆菌感受态的制备、转化  29-30
    2.2.6 质粒的转化  30
    2.2.7 含重组质粒的阳性菌落的检测  30
    2.2.8 发根农杆菌叶盘法介导的遗传转化  30-32
  2.3 转化体的分子检测  32-36
    2.3.1 转基因试管苗基因组 DNA提取及纯化  32-33
    2.3.2 转基因植株目的基因PCR反应  33
    2.3.3 转化植株的PCR-Southem印迹杂交  33-36
3 结果与分析  36-49
  3.1 最佳生根培养条件确立  36-39
    3.1.1 生根培养基及激素配比筛选  36-37
    3.1.2 生根培养中的其他影响因素  37-39
  3.2 最佳分化培养基的筛选  39-42
    3.2.1 分化培养基和激素配比的选择  39-41
    3.2.2 分化培养中应注意的其它问题  41-42
  3.3 关于最佳组培体系选择的小结  42
  3.4 抗生素敏感度的检测  42-45
    3.4.1 叶片对卡那霉素(选择压)的敏感度试验  42-43
    3.4.2 农杆菌对除菌剂敏感度试验  43
    3.4.3 叶片对头孢噻肟钠的敏感度试验  43-44
    3.4.4 组培苗生根卡那霉素敏感性试验  44-45
  3.5 农杆菌侵染和转基因植株的获得  45-47
    3.5.1 根癌农杆菌的质粒转化  45-46
    3.5.2 侵染时间对转化的影响  46
    3.5.3 其他影响因子  46
    3.5.4 转基因植株的获得  46-47
  3.6 转基因植株的分子生物学鉴定  47-49
    3.6.1 转基因植株总 DNA提取  47-48
    3.6.2 PCR扩增检测  48
    3.6.3 PCR-Southern杂交检测  48-49
结论  49-50
讨论  50-52
参考文献  52-57
附录  57-60
攻读学位期间发表的学术论文  60-61
致谢  61-62
独创性声明  62
学位论文版权使用授权书  62

杨树组培和欧美杨108无性系几丁质酶基因转化研究

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