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春石斛兰离体培养、再生过程生理变化及转基因初步研究

作　者: 侯大强
导　师: 柴明良
学　校: 浙江大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 春石斛兰(Dendrobium nobile Sw.) (类)原球茎抗氧化酶同工酶可溶性蛋白高度有机添加物生根再生体系农杆菌介导的转基因
分类号: S682.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

石斛属是兰科植物中的第二大属,其中金钗石斛(D.nobile)、铁皮石斛(D.candium)、霍山石斛(D.huoshanness)等是名贵的中草药;石斛属植物中有四分之一可供观赏,以花色艳丽、花期长著称。因此,对春石斛兰进行组织培养、生理生化及遗传转化的研究具有重要的意义。本试验以春石斛兰(Dendrobium nobile Sw.)为试材,系统地研究了离体培养中各种影响因子对类原球茎和芽的增殖、生长、生根以及长期培养后生长势恢复的影响;研究了在类原球茎分化芽和根系过程中,抗氧化酶系统中多种酶活性及可溶性蛋白的变化规律;同时,对农杆菌介导的春石斛兰转基因进行了初步研究,建立了重复浸染法。主要研究结果如下: (1) 在春石斛兰类原球茎途径的研究过程中,利用春石斛兰的茎节及嫩芽,在添加了0.2mg/LNAA的MS基本培养基上,成功诱导获得了绿色的质地优良的类原球茎;并进一步探索了类原球茎增殖的最佳生长调节剂浓度为BA 0.5mg/L;在对不同有机添加物的对比试验中发现,椰乳和蛋白胨对类原球茎鲜重的增加和增殖效果均较佳,其中以1.0g/L的蛋白胨最佳。 (2) 在芽途径的组织培养研究中,首次在石斛兰上利用腋芽萌发,成功恢复长期离体培养生长势减弱的材料,并通过调控外源氮素水平平衡芽的增殖和生长;优化NAA浓度(0.2mg/L),诱导丛生芽的产生,提高了芽的增殖率;同时发现,影响生长势减弱的春石斛兰生根的关键因素是芽的高度;当然,适宜浓度的蔗糖(20g/L)也是春石斛兰生根所必需的。 (3) 通过对类原球茎和生长势减弱材料芽增殖的研究发现,鲜重增加率/增殖率(F/P值)是衡量类原球茎或芽正常生长与否的一个重要指标。类原球茎的F/P值至0.6时,类原球茎生长健壮,色泽深绿;而F/P值<0.6时,类原球茎生长偏弱,色泽黄绿,部分黄化。而芽增殖的适宜的F/P值在1.14左右。F/P值的提出使春石斛兰生长势的强弱实现量化。 (4) 类原球茎分化过程中抗坏血酸过氧化物酶(APX)、愈创木酚过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化氢酶(CAT)的活性和可溶性蛋白含量均呈现先降后升的趋势;超氧化物歧化酶(SOD)活性则呈现先升后降的变化。其中POD是诱导根原基产生的关键酶;可以利用春石斛兰中POD的活性高低,作为鉴定根形态发生与否及生根难易的重要的生理指标。对过氧化物酶同工酶和可溶性蛋白进行SDS-PAGE电泳,进一步证实了类原球茎的分化成苗过程是一个蛋白调控、多种抗氧化酶共同参与的结果。通过对类原球茎分化过程中各种抗氧化酶、同工酶、可溶性蛋白变化规律研究,初步揭示了类原球茎分化过程中的部分规律,为通过生理指标指导组织培养的研究提供了重要的参考。

全文目录

缩写  8-9
摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
第一章文献综述  13-22
  1.1 石斛兰组织培养研究现状  13-16
    1.1.1 外植体的选择  13-14
    1.1.2 培养基选择  14
    1.1.3 生长调节剂的选择和使用  14-16
    1.1.4 其他影响因素  16
  1.2 兰科植物转基因研究现状  16-20
    1.2.1 外植体种类  16-18
    1.2.2 外植体的处理方法及筛选技巧  18-20
      1.1.2.1 外植体的前处理  18-19
      1.1.2.2 外植体的筛选  19-20
    1.2.3 抗生素类标记基因的确定  20
    1.2.4 转入的其他标记基因  20
  1.3 兰科植物的转基因研究前景展望  20-22
第二章春石斛兰离体繁殖体系的建立及优化  22-31
  2.1 材料与方法  22-24
    2.1.1 材料  22-23
    2.1.2 方法  23-24
      2.1.2.1 春石斛兰愈伤再生途径的研究  23
      2.1.2.2 春石斛兰PLB再生途径的研究  23-24
      2.1.2.3 春石斛兰芽离体快繁研究  24
    2.1.3 数据差异显著性分析  24
  2.2 结果与分析  24-29
    2.2.1 春石斛兰愈伤再生途径的研究  24-25
    2.2.2 春石斛兰PLB再生途径的研究  25-26
      2.2.2.1 不同生长调节剂对PLB诱导的影响  25
      2.2.2.2 不同浓度的BA对PLB增殖的影响  25
      2.2.2.3 不同有机添加物对PLB增殖的影响  25-26
    2.2.3 春石斛兰芽离体快繁研究  26-29
      2.2.3.1 不同氮素水平对芽增殖及鲜重增加的影响  26-28
      2.2.3.2 NAA对从生芽诱导的影响  28
      2.2.3.3 腋芽对春石解兰生长势恢复的影响  28
      2.2.3.4 嫩梢高度及IBA对生根的影响  28-29
      2.2.3.5 蔗糖浓度对嫩梢生根的影响  29
  2.3 讨论  29-30
  2.4 小结  30-31
第三章春石斛兰类原球茎发生及分化过程中的生理生化变化  31-40
  3.1 材料与方法  31-34
    3.1.1 材料  31
    3.1.2 方法  31-34
      3.1.2.1 PLB分化过程中的抗氧化酶类的变化  31-32
      3.1.2.2 PLB分化过程中的POD同工酶的变化  32-33
      3.1.2.3 PLB分化过程中可溶性蛋白含量的变化及SDS-PAGE电泳  33-34
  3.2 结果与分析  34-37
    3.2.1 PLB分化过程中的抗氧化酶类的活性变化  34-35
      3.2.1.1 PLB分化过程中的抗氧化物酶类的活性变化  34-35
      3.2.1.2 多酚氧化酶(PPO)活性变化  35
    3.2.2 PLB分化过程中的POD同工酶的变化  35-36
    3.2.3 PLB分化过程中可溶性蛋白含量的变化及SDS-PAGE电泳  36-37
      3.2.3.1 PLB分化过程中可溶性蛋白含量的变化  36
      3.2.3.2 PLB分化过程中可溶性蛋白SDS-PAGE电泳  36-37
  3.3 讨论  37-39
    3.3.1 抗氧化酶类的活性变化与PLB分化的关系  37-39
    3.3.2 POD同工酶的变化与PLB分化的关系  39
    3.3.3 可溶性蛋白的变化与PLB分化的关系  39
  3.4 小结  39-40
第四章春石斛兰遗传转化体系的建立  40-47
  4.1 材料与方法  40-44
    4.1.1 材料  40-42
      4.1.1.1 外植体  40-41
      4.1.1.2 质粒载体  41
      4.1.1.3 培养基  41-42
    4.1.2 农杆菌侵染方法  42-43
      4.1.2.1 液体浸染法  42
      4.1.2.2 固体共培养法  42
      4.1.2.3 重复侵染法  42-43
    4.1.3 转化材料的鉴定  43-44
      4.1.3.1 转化材料的X-gluc组织化学染色  43
      4.1.3.2 转基因植株的PCR检测  43-44
  4.2 结果与分析  44-46
    4.2.1 不同农杆菌侵染方式对PLB生长的影响  44-45
    4.2.2 转化植株的GUS染色及PCR分析  45-46
  4.3 讨论  46
  4.4 小结  46-47
参考文献  47-58
硕士期间发表的论文  58

春石斛兰离体培养、再生过程生理变化及转基因初步研究

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