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口蹄疫病毒OH/99株细胞传代毒全基因组序列测定及其感染性克隆的构建

作　者: 方先珍
导　师: 刘在新；胡永浩
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 口蹄疫病毒全长感染性cDNA克隆基因组
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease, FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV）引起的偶蹄动物感染的一种烈性传染病，该病的发生和流行严重危害畜牧业的持续健康发展，因此，世界各国非常重视对该病的研究。本研究根据FMDV的基因组核苷酸序列设计并合成了数对反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）的寡核苷酸引物。利用3′-RACE方法从OH/99株细胞传代毒中扩增得到一7300bp片段，同时，采用常规RT-PCR技术扩增得到其5′-非翻译区（5′-untranslated region, 5′-UTR）的S片段和内部核糖体进入位点序列（internal ribosome entry site, IRES），分别克隆至pGEM-T Easy 载体中进行序列测定。应用连接PCR的方法将15bp poly（C）序列插入S和IRES两片段之间，并将连接片段插入pBluescript SK，然后将7300bp片段从pGEM-T Easy载体上切下，插入重组体pBluescript SK中，构建了OH/99株全长cDNA。以全长cDNA重组质粒为模板进行全长PCR扩增，PCR产物经NdeⅠ消化后，利用噬菌体T7启动子聚合酶系统启始合成RNA转录本，借助脂质体将RNA转录本转染BHK-21细胞。转染细胞连续传3代后出现典型的细胞病变，通过RT-PCR和电子显微镜观察均确证了感染性病毒粒子的产生。将此基因工程毒接种乳鼠后出现了典型的临床症状，进一步说明了FMDV OH/99 株感染性克隆构建成功。本研究为FMDV 基因组结构和功能的研究奠定了良好的基础，也为新型疫苗的研究提供了非常有用的工具。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-6
1 前言  6-7
2 材料与方法  7-21
  2.1 材料  7-8
    2.1.1 病毒株、菌种、细胞和载体  7
    2.1.2 各种酶类和生物试剂  7
    2.1.3 引物设计  7-8
    2.1.4 实验动物  8
  2.2 方法  8-21
    2.2.1 口蹄疫病毒OH/99株全基因组的克隆  8-14
      2.2.1.1 病毒总RNA的提取  8
      2.2.1.2 反转录  8-9
      2.2.1.3 PCR 扩增  9-10
      2.2.1.4 PCR 产物的纯化与回收  10-11
      2.2.1.5 PCR 产物与pGEM-T Easy载体的克隆  11-12
      2.2.1.6 感受态细胞的制备  12
      2.2.1.7 感受态细胞的转化  12-13
      2.2.1.8 挑斑  13
      2.2.1.9 重组质粒的提取  13
      2.2.1.10 重组质粒的鉴定  13-14
    2.2.2 口蹄疫病毒OH/99株全长cDNA的构建  14-18
      2.2.2.1 5′半长cDNA的构建  14-17
      2.2.2.2 全长重组质粒的构建 14 2.2.3 体外转录模板的制备  17-18
    2.2.3 体钋转录模板的制备  18-19
      2.2.3.1 FMDV全长PCR  18-19
      2.2.3.2 FMDV 全长 PCR 产物的线化  19
    2.2.4 体外转录本的制备  19-20
    2.2.5 RNA 转录本的纯化及鉴定  20
    2.2.6 FMDV基因组RNA 转染BHK-21细胞  20
    2.2.7 全长cDNA感染性的鉴定  20-21
      2.2.7.1 BHK-21 细胞的病变效应  20-21
      2.2.7.2 动物实验  21
      2.2.7.3 基因工程毒的RT-PCR  21
      2.2.7.4 电镜观察病毒粒子  21
3 结果  21-27
  3.1 口蹄疫病毒OH/99株全基因组的克隆  21-22
  3.2 口蹄疫病毒OH/99株全长cDNA的分子克隆  22
  3.3 体外模板的制备  22-23
  3.4 体外转录  23
  3.5 全长 cDNA 感染性的鉴定  23-27
4 讨论  27-29
结论  29-30
文献综述  30-43
参考文献  43-47
附录  47-55
致谢  55

口蹄疫病毒OH/99株细胞传代毒全基因组序列测定及其感染性克隆的构建

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