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氟伐他汀抑制Rho激酶信号通路减少HK-2细胞纤维连接蛋白表达的研究

作　者: 舒洁
导　师: 刘佳
学　校: 南京医科大学
专　业: 内科学
关键词: 氟伐他汀 HK-2细胞 Rho激酶 糖尿病肾病 纤维连接蛋白
分类号: R587.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最严重的微血管并发症之一,其已成为终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的首位原因和糖尿病的主要致死、致残原因。以往对糖尿病肾病的研究多着重于肾小球,近年研究发现早期糖尿病肾病同时存在肾小球和肾小管的功能异常,肾小管病变在糖尿病肾病的发生及发展中也起着重要作用。近年研究发现,他汀类药物可抑制甲羟戊酸代谢产物-异戊二烯类化合物如焦磷酸法尼酯(FPP)和牛龙牛儿(基)焦磷酸(GGPP)的合成,使依赖FPP、GGPP修饰的小GTP蛋白不能定位于细胞膜,从而抑制细胞内信号传导起到抗炎抗增殖等非降脂肾脏保护作用。Rho激酶是小G蛋白RhoA下游最主要、最具特色的信号分子,在多种因素的作用下被激活,在糖尿病肾病的发生发展中发挥一定的作用。为进一步观察他汀类药物对糖尿病肾病的保护作用机制,本实验通过体外培养人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞),观察氟伐他汀对高糖诱导的HK-2细胞细胞外基质的影响,及其与Rho激酶信号通路的内在联系,以探讨氟伐他汀可能的肾脏保护机制。【目的】1.探讨高糖对人肾小管上皮细胞纤维连接蛋白表达的影响。2.探讨氟伐他汀抑制高糖诱导的人肾小管上皮细胞纤维连接蛋白表达的作用机制。3.探讨Rho激酶信号通路在高糖诱导人肾小管上皮细胞纤维连接蛋白表达中的作用。4.探讨Rho激酶激动剂LPA、异戊二烯类化合物——甲羟戊酸、GGPP、FPP与Rho激酶信号通路及氟伐他汀的联系。【方法】1. HK-2细胞的培养与传代:HK-2细胞置于含10%胎牛血清及青/链霉素(100U/ml)的DMEM培养液中,37℃孵箱(5%CO2)培养。HK-2细胞生长至对数生长期时,吸去培养液,加入胰蛋白酶于37度孵箱消化2min左右,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化,收集细胞悬液,离心,弃上清液,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬,以5*104个/cm2接种。2. HK-2细胞的分组与干预:待细胞生长至对数生长期时换无血清的培养液同步24小时,使细胞同步于G0期。将细胞分组:①0h组;6h组; 12组; 24组②正常糖组;甘露醇组;高糖组;高糖+氟伐他汀低剂量组;高糖+氟伐他汀中剂量组;高糖+氟伐他汀高剂量组③正常糖组;高糖组;高糖+氟伐他汀12h组;高糖+氟伐他汀+LPA组;高糖+氟伐他汀20h组④高糖组;高糖+氟伐他汀中剂量组;高糖+氟伐他汀中剂量组+甲羟戊酸组;高糖+氟伐他汀中剂量组+GGPP组;高糖+氟伐他汀中剂量组+FPP组。3.Western Blot检测HK-2细胞p-MYPT1(Rho激酶功能活化的标志)、FN的表达【结果】1.高糖对HK-2细胞p-MYPT1、FN表达的影响(Western Blot)与高糖刺激0h对照组相比,高糖刺激HK-2细胞6h、12h、24h均可引起p-MYPT1显著活化(p<0.05),刺激12h后p-MYPT1活性达峰值(p<0.01)。高糖诱导的FN的表达呈时间依赖性,随着高糖刺激时间的延长,FN的表达逐渐增多(p<0.05或p<0.01)。2.氟伐他汀对HK-2细胞p-MYPT1、FN表达的影响(Western Blot)体外培养HK-2细胞12h,和正常糖对照组相比高糖组p-MYPT1和FN的表达显著增加(P<0.01),氟伐他汀(10-7 , 10-6和10-5 mol/L)处理组p-MYPT1和FN的表达均较高糖组降低,并呈浓度依赖性(P<0.05)3. LPA对p-MYPT1、FN表达的影响(Western Blot)在观察LPA对p-MYPT1、FN表达的影响的实验中,体外培养的HK-2细胞分为以下五组:正常糖组;高糖组;高糖+氟伐他汀12h组;高糖+氟伐他汀+LPA组;高糖+氟伐他汀20h组。高糖+氟伐他汀+LPA组p-MYPT1、FN的表达均高于氟伐他汀12h组和氟伐他汀20h组(P<0.05)4.氟伐他汀和甲羟戊酸、FPP、GGPP对p-MYPT1、FN表达的影响(Western Blot)和高糖组相比,氟伐他汀中剂量组和FPP组p-MYPT1、FN的表达降低(P<0.05),和氟伐他汀中剂量组相比,甲羟戊酸组和GGPP组p-MYPT1、FN的表达明显升高(P<0.05)。【结论】1.高糖可以诱导Rho激酶及FN的表达。2.氟伐他汀可以抑制高糖诱导的Rho激酶及FN的表达,并呈浓度依赖性。3.氟伐他汀可能通过抑制Rho激酶磷酸化进而抑制细胞外基质纤维连接蛋白的表达。4. Rho激酶信号通路可能是糖尿病肾病肾间质纤维化发生的始动信号之一。

全文目录


主要英文缩略语词表  4-6
中文摘要  6-9
Abstract  9-14
前言  14-15
材料  15-21
方法  21-25
结果  25-33
讨论  33-36
结论  36-37
参考文献  37-42
综述 他汀类药物发挥多效性对糖尿病肾病的防治进展  42-54
  参考文献  48-54
个人小结  54-55
附录  55-64
致谢  64-65

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病性昏迷及其他并发症
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