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山核桃嫁接成活相关基因克隆

作　者: 褚怀亮
导　师: 郑炳松；黄坚钦
学　校: 浙江林学院
专　业: 森林培育
关键词: 山核桃嫁接基因克隆 cDNA-AFLP 定量RT-PCR
分类号: S664.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

嫁接是一门园艺技术,其成活过程包含细胞脱分化、再分化等重大理论问题。山核桃嫁接是公认的难题,为了深入探索这一珍贵物种的嫁接分子机理和调控机制,本研究采用cDNA-AFLP技术和定量RT-PCR技术对山核桃嫁接成活相关基因进行筛选、分离和生物信息学分析,结果表明:1.利用改良的CTAB法提取的嫁接样品总RNA质量高、完整性好、无杂质,适用于cDNA-AFLP分析和荧光定量RT-PCR分析。2.利用SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit反转录获得的8个实验材料双链cDNA,完整性好,满足实验要求。3.用识别4碱基和6碱基的限制性内切酶TaqI、AseI消化cDNA,所得片段长度符合技术要求。酶切片段与人工接头连接后进行预扩,获得相当浓度的200～1000bp的酶切片段拷贝。4.选用100对选扩引物进行了选择性扩增。改进选扩程序,采用高温(65℃)退火结合循环降温方法,获得高浓度的特异性产物。5.用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染对选扩产物进行差异显示,结果共获得300多条差异表达片段。经切胶回收、纯化和二次克隆等所得差异片段100多条。共测回来的序列66条,经Blast比序,除去重复序列17条,结果获得了49条TDFs。6.选取其中12条基因进行定量RT-PCR验证分析,结果显示,其中八个克隆translational initiation factor eIF-4A,3’-5’-exoribonuclease/ RNA binding (AT2G47220),18号未知基因,isolate K1/E32 K1 glycoprotein,putative auxin response factor 1,water channel (PIP1B),Glycine max catalase (cat4),65号未知基因与cDNA-AFLP的表达一致,一个克隆25号未知基因与cDNA-AFLP的表达基本一致,而其余三个克隆17号未知基因,beta family G-protein,cdc20 protein (CDC20.2)的表达与cDNA-AFLP的表达结果有差异。本实验cDNA-AFLP的表达谱中的75%得到验证。7.在49条TDFs中,有20个编码已知功能蛋白,8个编码未知功能蛋白,其余的21个与未注释的基因组序列相似,或者在核苷酸数据库无同源序列。对20个已知功能的基因进行功能分析,它们分属于物质运输,代谢和能量,细胞周期,信号转导等9类,说明山核桃嫁接过程中发生了复杂的代谢变化。根据所获得的差异表达基因,初步绘制了山核桃嫁接调控关系图,从分子水平上证实了现代嫁接的细胞生物学理论。本研究首次将cDNA-AFLP技术和定量RT-PCR分析技术应用于山核桃基因的差异表达研究,并对其加以改进,成功分离到山核桃嫁接成活相关基因。根据这些差异片段序列制作探针或转化成相应的分子标记,可以为嫁接成活基因的定位、克隆以及基因表达特性的研究提供理论依据。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-14
1 文献综述  14-24
  1.1 植物嫁接成活机理研究  14-19
    1.1.1 嫁接形态解剖学机理  14-15
    1.1.2 嫁接成活生理生化机理  15-18
      1.1.2.1 水分  15
      1.1.2.2 养分  15
      1.1.2.3 激素  15-16
      1.1.2.4 净光合速率(fn)  16-18
      1.1.2.5 呼吸  18
    1.1.3 嫁接成活分子机理  18-19
      1.1.3.1 基因  18
      1.1.3.2 蛋白质  18-19
    1.1.4 植物嫁接的展望  19
  1.2 CDNA-AFLP 技术原理及特点  19-21
    1.2.1 cDNA-AFLP 技术原理  19-20
    1.2.2 cDNA-AFLP 技术特点  20-21
      1.2.2.1 重复性高，可检测低丰度表达的mRNA  20
      1.2.2.2 可准确地反映基因间表达量的差异  20-21
      1.2.2.3 全面获取转录组的表达信息  21
  1.3 CDNA-AFLP 技术在植物上的应用  21-24
    1.3.1 基因表达特性的研究  21-22
    1.3.2 构建转录图谱  22
    1.3.3 分离特异表达的基因  22-24
2 材料与方法  24-40
  2.1 材料准备  24-26
    2.1.1 植物材料  24
    2.1.2 主要仪器  24
    2.1.3 试剂及来源  24-25
    2.1.4 接头和引物序列  25-26
  2.2 RNA 的提取及纯化  26-28
    2.2.1 RNA 提取  26-27
    2.2.2 总RNA 提取质量检测  27
    2.2.3 mRNA 纯化  27-28
  2.3 CDNA-AFLP  28-32
    2.3.1 双链cDNA 的合成  28-29
      2.3.1.1 第一链cDNA 合成  28-29
      2.3.1.2 第二链cDNA 合成  29
      2.3.1.3 用QIAquick PCR Purification Kit 纯化cDNA  29
    2.3.2 cDNA 酶切连接  29-30
      2.3.2.1 TaqI 酶切  29-30
      2.3.2.2 AseI 酶切  30
      2.3.2.3 连接  30
    2.3.3 预扩增  30-31
    2.3.4 选择性扩增  31
    2.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳  31-32
      2.3.5.1 配制测序胶  31-32
      2.3.5.2 测序胶电泳  32
      2.3.5.3 测序胶银染  32
  2.4 特异片段克隆测序  32-37
    2.4.1 特异片段回收  32-33
    2.4.2 扩增片段纯化  33-34
    2.4.3 PCR 产物与T-Vector 的连接  34
    2.4.4 感受态细胞制备(CaC12 法)  34
    2.4.5 质粒转化  34-35
    2.4.6 质粒提取并进行酶切检测  35-36
    2.4.7 PCR 鉴定  36
    2.4.8 序列测定  36-37
  2.5 定量RT-PCR 方法  37-39
    2.5.1 植物材料  37
    2.5.2 RNA 提取  37
    2.5.3 选择内参  37
    2.5.4 定量RT-PCR 分析引物设计  37-38
    2.5.5 定量RT-PCR 操作方法  38-39
      2.5.5.1 按下列组份配制反转录反应液(反应液配制请在冰上进行)  38-39
      2.5.5.2 Real Time PCR 反应  39
  2.6 序列比对  39-40
3 结果与分析  40-49
  3.1 RNA 提取电泳图  40
  3.2 CDNA-AFLP 分析  40-42
    3.2.1 山核桃cDNA 合成  40-41
    3.2.2 预扩增  41
    3.2.3 选择性扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳图  41-42
  3.3 特异片段克隆测序分析  42-44
    3.3.1 回收二次扩增产物结果分析  42-43
    3.3.2 纯化回收产物分析  43
    3.3.3 重组质粒提取及酶切结果分析  43-44
    3.3.4 测得的所有序列  44
  3.4 定量RT－PCR 分析  44-46
  3.5 序列功能分析  46-49
4 讨论  49-55
  4.1 RNA 提取  49
  4.2 CDNA-AFLP 体系的建立与优化  49-50
    4.2.1 模板质量是影响实验结果的主要因素  49
    4.2.2 cDNA-AFLP 反应条件的优化  49
    4.2.3 差异片段的检测  49-50
  4.3 特异片段克隆测序  50
  4.4 定量RT－PCR  50-51
  4.5 嫁接调控网络初探  51-54
    4.5.1 4 个基因可能在嫁接过程中参与信号转导和IAA 运输相关基因的表达调控  52-53
    4.5.2 水孔蛋白PIP18 在山核桃嫁接过程中增强表达  53
    4.5.3 生长素响应因子(ARF)在山核桃嫁接过程中抑制表达  53-54
  4.6 下一步工作构想  54-55
5 结论  55-56
参考文献  56-61
附表  61-77
作者简介  77
攻读硕士期间发表论文  77-78
致谢  78

山核桃嫁接成活相关基因克隆

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