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耐热β-葡萄糖苷酶细菌的筛选、基因的克隆与表达

作　者: 廖德芳
导　师: 石贵阳
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 耐热β-葡萄糖苷酶筛选地衣芽孢杆菌大肠杆菌BL21(DE3) 基因克隆
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase; EC.3.2.1.21）是纤维素酶系中一种重要的水解酶,在工业、农业、医药等领域都有广泛的应用。耐热性β-葡萄糖苷酶具有加快反应速率、降低能耗等优势,在食品发酵、燃料乙醇等领域中具有广阔的应用前景。本文旨在探索一种能与糖化酶协同作用的耐热性β-葡萄糖苷酶,以达到提高淀粉质原料燃料乙醇生产过程中的原料利用率和出酒率的目的。本文首先通过筛选获得了1株产β-葡萄糖苷酶能力较强的嗜热细菌（F157043A）,经过16S rDNA分子生物学鉴定、形态分析以及生理生化鉴定,确定该菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）,进一步对该菌的粗酶液进行了酶学性质分析,并将β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中成功地进行了克隆表达。1.从中国高校工业微生物资源和信息中心（CICIM-CU）菌种库中的1323株细菌保藏物中筛选出20株产β-葡萄糖苷酶能力较强的细菌;通过16S rDNA序列鉴定,初步确定其中5株为嗜热溶胞土芽孢杆菌（Geobacillus sp.）,其余为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）;进一步复筛获得两株产酶能力较优的细菌（编号为170-28-2的嗜热溶胞杆菌与编号为F157043A的地衣芽孢杆菌）并对其产生的β-葡萄糖苷酶酶学性质进行了初步的分析;选取具有较好耐热性与较宽pH耐受性的F157043A菌株作进一步的研究。2.通过对编号为F157043A的细菌进行菌体和菌落形态观察以及生理生化特征分析,进一步鉴定该菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。3.对该菌β-葡萄糖苷酶的粗酶液酶学性质分析发现:该酶最适反应温度为55℃,在60℃酶活力保持在80%以上;最适反应pH值为9.0,在pH为6.0～9.0范围内酶比较稳定;木糖、葡萄糖、果糖对该酶的酶活力有明显的抑制作用;Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、SDS对酶活力有很强的抑制作用,Mg²⁺、Co²⁺、Mn²⁺对酶活力有明显的激活作用;不同浓度的酒精对酶活力有不同程度的抑制作用。4.以地衣芽孢杆菌F157043A的染色体为模板PCR扩增获得1410bp的β-葡萄糖苷酶基因（bglH）,将该片段连接至表达载体pET-20b（+）中并转化大肠杆菌BL21（DE3）获得重组子;重组菌经IPTG诱导表达后,在SDS-PAGE上检测到约53 kDa的重组蛋白条带;在60℃条件下重组菌粗酶液比酶活为0.14 U/mg,对照菌粗酶液比酶活为0.04 U/mg;在较适诱导条件下重组菌粗酶液比酶活为0.54 U/mg,提高了约4倍。5.针对实验过程中发现大肠杆菌BL21（DE3）具有本底β-葡萄糖苷酶酶活而公开文献均未提及这一现象,通过设计实验证明并初步阐明了IPTG能够促进大肠杆菌BL21（DE3）的磷酸化β-葡萄糖苷酶A的生成。

耐热β-葡萄糖苷酶细菌的筛选、基因的克隆与表达

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