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检测A群猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条的制备

作　者: 刘兆磊
导　师: 李一经
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪轮状病毒 胶体金 免疫层析 试纸条
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


猪轮状病毒感染在我国和世界各养猪国家普遍存在。快速准确地疾病监测是防治该病的前提条件,虽然轮状病毒检测有多种方法,但适用于现场对病原作出快速检测的方法还很有限,基于此本研究运用胶体金免疫层析技术,建立一种快速、简便、灵敏的检测A群猪轮状病毒的方法。将纯化的重组PRV VP6蛋白免疫兔子,制备得到抗VP6蛋白的多克隆抗血清;用抗PRV VP6蛋白杂交瘤细胞株C5D10注射BALB/C小鼠,制备得到抗PRV VP6蛋白腹水单抗。采取辛酸-硫酸铵盐析法和蛋白A(及G)亲和层析法对多克隆抗血清和腹水单抗进行两步纯化,纯化后的抗体用间接ELISA和SDS-PAGE检测其效价和提纯效果,SDS-PAGE结果显示提纯后的抗体没有杂带,主要为γ球蛋白,纯化后的单抗与多抗同VP6蛋白ELISA效价分别为10-5和1:1200;采用柠檬酸三钠还原法制备20nm的胶体金颗粒,胶体金标记纯化后的单抗,最佳标记量和最适pH值的测定结果分别为60μg/ml和PH8.5,低温超速离心法纯化标记好的金标单抗;纯化后的胶体金标记抗体作1:2.5稀释,吸附于玻璃纤维。用纯化后的多抗在硝酸纤维素膜(HF135)上划线作为检测线,最适划线浓度为0.8mg/ ml;用羊抗鼠IgG在硝酸纤维素膜(HF135)上划线作为质控线,最适划线浓度为0.5 mg/ml。检测试纸条对PRV培养液和未接种病毒的细胞对照液作为已知阳性和阴性进行实验,检测时间约10min,病毒培养液在检测线和质控线出现两条明显的红色条带,检验结果为阳性,而细胞对照液只在质控线上出现红色条带,在检测线未出现,检验结果呈阴性,与预期设计的结果相一致。对试纸条进行了敏感性、重复性、特异性实验。结果显示:试纸条检出病毒培养液(TCID50是0.1ml 10-6.25)最低限度为1:32稀释;不同批次试纸条重复检测,结果无明显差异;试纸条不与猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒相关腹泻病毒发生反应,表明所制备的试纸条具有一定的敏感性、重复性和特异性。本研究所建立的检测抗原的胶体金免疫层析试纸条,为猪轮状病毒病的快速诊断奠定了基础。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-9
1 引言  9-20
  1.1 轮状病毒的研究进展  9-12
    1.1.1 轮状病毒粒子的形态结构  10
    1.1.2 轮状病毒表面抗原与分型  10-11
    1.1.3 轮状病毒的培养特性和理化特性  11-12
  1.2 猪轮状病毒流行病学研究  12-13
  1.3 轮状病毒诊断方法  13-15
    1.3.1 RV 主要的诊断和检测方法  13-15
    1.3.2 猪轮状病毒诊断方法  15
  1.4 免疫胶体金概述  15-19
    1.4.1 免疫胶体金技术的原理  16
    1.4.2 免疫胶体金技术的特点  16-17
    1.4.3 免疫胶体金技术的应用  17-19
  1.5 研究的目的和意义  19-20
2 材料与方法  20-28
  2.1 材料  20-22
    2.1.1 动物与细胞  20
    2.1.2 病毒  20
    2.1.3 免疫原  20
    2.1.4 主要试剂和溶液  20-21
    2.1.5 主要仪器设备  21-22
  2.2 方法  22-28
    2.2.1 PRV-VP6 单抗腹水的制备和纯化  22-23
    2.2.2 兔抗VP6 多克隆抗体的制备与纯化  23-24
    2.2.3 胶体金的制备和抗体的标记  24-25
    2.2.4 试纸条的制作  25-26
    2.2.5 制作试纸条最佳条件的确定  26-27
    2.2.6 试纸条的性能测试  27-28
3 结果  28-36
  3.1 抗猪轮状病毒VP6 蛋白多克隆抗血清的制备和纯化结果  28-29
    3.1.1 重组抗原VP6 在大肠杆菌的表达及纯化结果  28
    3.1.2 抗猪轮状病毒VP6 蛋白多克隆抗血清的纯化结果  28-29
  3.2 抗猪轮状病毒VP6 蛋白单抗的纯化结果  29-30
  3.3 金标抗体制备过程中条件的确定结果  30-31
    3.3.1 胶体金制备过程中柠檬酸三钠加入量的确定结果  30
    3.3.2 PRV-VP6 单抗与胶体金结合最佳pH 测定  30
    3.3.3 胶体金标记抗体最适量的确定  30-31
  3.4 胶体金与金标抗体的质量鉴定结果  31-33
    3.4.1 胶体金颗粒的质量鉴定  31-32
    3.4.2 金标抗体的鉴定  32-33
  3.5 制作试纸条最佳条件的筛选结果  33-34
    3.5.1 硝酸纤维素薄膜（NCM）的选择结果  33
    3.5.2 硝酸纤维素膜（NCM）封闭剂浓度的选择结果  33-34
    3.5.3 硝酸纤维素膜(NCM)抗体包被浓度的确定  34
    3.5.4 金标抗体稀释倍数的选择结果  34
  3.6 胶体金试纸条的测试结果  34-36
    3.6.1 试纸条的检测结果  34-35
    3.6.2 敏感性实验结果  35
    3.6.3 特异性实验结果  35
    3.6.4 重复性实验结果  35-36
4 讨论  36-41
  4.1 胶体金免疫层析试纸条在检测猪轮状病毒的潜在应用价值  36
  4.2 关于抗体的纯化  36-37
  4.3 金颗粒的制备与标记  37-38
  4.4 试纸条的制作  38-40
    4.4.1 试纸条制作工艺  38
    4.4.2 试纸条材料的选择问题  38-39
    4.4.3 试纸条制作各种用量的确定  39
    4.4.4 试纸条的组装和保存  39
    4.4.5 假阳性的原因分析和解决方案  39-40
  4.5 制作胶体金免疫层析试纸的原理  40-41
5 结论  41-42
致谢  42-43
参考文献  43-49
攻读硕士学位期间发表的论文  49

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医临床医学 > 兽医诊断学 > 实验室诊断法
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